二氢槲皮素对IgA肾病大鼠肾脏保护的机制

2022-08-03师旭辉于建军曲矿云刘风勋

西北药学杂志 2022年5期

师旭辉 ,于建军 ,秦洋 ,曲矿云* ,刘风勋

1.黄河三门峡医院肾脏内科,三门峡 472000;2.郑州大学第一附属医院肾内科,郑州 450000

IgA 肾病(IgA nephropathy,IgAN)是一种慢性进展性疾病,多数患者最终发展为肾功能衰竭[1]。目前对终末期肾病患者,除肾脏替代治疗外,尚无特异性治疗手段,因此,探寻延缓IgAN 进展、减轻肾脏病理变化的治疗方法十分必要[2]。二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)存在于花旗松、落叶松等植物中,属于二氢黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、调节免疫、抗肿瘤等生物效应[3]。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(protein kinase B,Akt)信号通路参与细胞分化、凋亡、增殖等生命活动[4-5],上调PI3K/Akt信号通路的表达,可加重肾小管上皮细胞炎性损伤[6],表明PI3K/Akt信号通路与肾脏疾病的发展密切相关。本研究通过建立IgAN 大鼠模型,分析DHQ 对IgAN 大鼠肾脏的保护作用及其对PI3K/Akt信号通路的作用机制,为临床治疗提供实验与理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

7600-020型全自动生化分析仪(日立公司);DYCZ-20G 型电泳仪(北京六一生物科技有限公司);1000-液晶型超声细胞破碎仪(南京赛飞生物科技有限公司);TGL20M 型台式超低温离心机(河南信陵仪器设备有限公司)。

1.2 试药

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,质量分数为97%)、Masson染色液均购自北京索莱宝科技有限公司;四氯化碳(CCl4)、HE 染色液均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蓖麻油(北京伊诺凯科技有限公司);脂多糖(大连美仑生物技术有限公司);二氢槲皮素(DHQ,质量分数≥98%)和740Y-P(质量分数＞96%),均购自上海麦克林生化科技有限公司);TLR4 荧光一抗以及Akt、p-Akt、PI3K 及p-PI3K 抗体均购自美国Abcam 公司

1.3 动物

SPF清洁级SD 雄性大鼠78只,8周龄,体质量为(175±25) g,购自北京唯尚立德生物科技有限公司,许可证号为SCXK(京)2016-0009,用普通饲料进行适应性喂养,自由进食、饮水,喂养1周,实施封闭管理。

2 方法

2.1 建立IgA 肾病大鼠模型

将78 只大鼠分为对照组(15 只)与干预组(63只),对照组不进行任何干预,干预组灌服BSA溶液(20 g BSA+500 mL 生理盐水,制成质量浓度为40 mg·mL-1的BSA 溶液),隔日1 次,连续处理6周;每周予以0.1 mL CCl4+0.5 mL蓖麻油皮下注射,连续处理9周;并于第6周、第8周时,于大鼠尾静脉注射0.05 mg脂多糖(将10 mg脂多糖充分溶解于1 mL生理盐水中,再取脂多糖溶液500 μL+生理盐水100 mL 混匀),直接免疫荧光染色显示系膜区有大量IgA 沉积为造模成功[7]。

2.2 动物分组与干预

干预组纳入造模成功的大鼠58只,随机分为模型组(14只)、740Y-P组(14只)、DHQ组(15只)、740Y-P+DHQ 组(15 只)。DHQ 组每日用100 mg·kg-1的DHQ溶液(用体积分数0.4%羧甲基纤维素钠配制)灌胃;740Y-P组腹腔注射740Y-P溶液0.02 mg·kg-1,每日1次;740Y-P+DHQ 组大鼠每日用100 mg·kg-1DHQ溶液灌胃,并腹腔注射740Y-P溶液0.02 mg·kg-1;对照组、模型组用等量生理盐水灌胃及腹腔注射。上述5组均连续处理12周。

2.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清炎性因子水平

末次干预后2 h,将各组大鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉,采集5 mL 腹主动脉血,以3 000 r·min-1离心20 min(离心半径为10 cm),取血清,用ELISA 检测大鼠血清炎性因子,按照说明书中的步骤稀释后加样。设置空白孔与样本孔,样本孔加酶标试剂,封板后于37 ℃温育30 min,加洗涤液,静置30 s后弃去,重复5次,拍干,加入显色剂,37 ℃避光显色10 min,加入终止液终止反应,检测450 nm 处各孔的吸光度,计算大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平。

2.4 全自动生化分析仪测定大鼠肾功能

于末次给药前24 h收集大鼠尿液,去沉渣,用双缩脲法测定各组大鼠24 h尿蛋白定量(24 hours urinary protein quantitative,24 h pro);末次干预后取腹主动脉血标本,以3 000 r·min-1离心20 min(离心半径为10 cm)后,用全自动生化分析仪测定血清肌酐(serum creatinine,Scr)及血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平。

2.5 HE染色检测大鼠肾组织变化

采血完毕,处死大鼠,摘取两侧肾脏,用体积分数4%多聚甲醛固定(24 h)左肾组织,冲去肾组织表面的结晶,用体积分数70%、85%、95%、100%、100%乙醇脱水,每梯度30 min,二甲苯透明,浸蜡包埋,切成厚度3 μm 的病理切片;将切片依次放入二甲苯脱蜡15 min(3次),无水乙醇水化,滴加苏木素染液染色8 min,用自来水冲洗,擦干多余水分,滴加分化液3～4 s,流水冲洗,滴加伊红染料2 min,乙醇浸润,切片组织稍干后用中性树胶封片,置于显微镜下观察肾组织变化。

2.6 Masson染色观察大鼠肾纤维化

将4 μm石蜡切片放置于60 ℃烤箱,放置3～5 h,脱蜡水化,将Masson 复合染色液适量滴加在组织上,30 s后用蒸馏水冲洗,加入磷钼酸盐(5 min),甩干磷钼酸盐,滴加苯胺蓝染色(5 min),用蒸馏水冲洗,滴加分化液2次,45 s后甩干;将组织玻片依次放入体积分数为95%的乙醇溶液(1次)、乙醇(2次)浸润10 s,浸入二甲苯2 min(2次),玻片稍干后封片,置于显微镜下观察染色情况。

2.7 直接免疫荧光染色检测IgA 沉积

将6 μm 冰冻切片用体积分数4%甲醛固定(10 min),用PBS冲洗,插入玻片架,用柠檬酸盐缓冲液浸润,高压抗原修复3 min,取出玻片,冷却至室温,用PBS冲洗3次,每次5 min,滴加TLR4荧光一抗(FITC标记),置于4 ℃冰箱中避光孵育;次日用PBS冲洗3次,每次5 min,稍干后滴加抗荧光淬灭剂(50～100 μL),封片,于-20 ℃保存。

2.8 Western blot测定大鼠Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白的表达水平

取保存于液氮中的右肾,加入蛋白裂解液1 mL,用超声细胞破碎仪破碎细胞(3 min),以12 000 r·min-1离心10 min,提取总蛋白,用蛋白质定量法检测各组大鼠右肾蛋白质量浓度,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,转膜,用Tween-20磷酸盐缓冲液封闭(含质量浓度为5 g·L-1的脱脂奶粉)1 h,加入Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜,次日用TBST洗膜,加入IgG 二抗(1∶5 000)孵育2 h,ECL曝光,置于凝胶成像分析系统,以β-actin为内参,分析目的蛋白的表达水平。

2.9 统计学方法

用Image-Pro plus 6.0软件采集与分析图像,用SPSS 22.0软件分析数据,计量资料以()表示,多组间比较用单因素方差分析,进一步两两比较用LSD-t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 DHQ 对IgA 肾病大鼠炎性因子含量的影响

与对照组比较,模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6 的含量升高(P＜0.05);与模型组比较,740Y-P组大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6的含量升高,DHQ 组、DHQ+740Y-P 组大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6 的含量降低(P＜0.05);与DHQ+740Y-P组比较,DHQ 组血清IL-1β、TNF-α和IL-6的含量降低(P＜0.05)。结果见表1。

表1 DHQ 对IgA肾病大鼠血清IL-1β、TNF-α 和IL-6水平的影响 ()Tab.1 Effect of dihydroquercetin on serum IL-1β,TNF-α and IL-6 levels in rats with IgA nephropathy ()

注:与对照组比较,aP＜0.05;与模型组比较,bP＜0.05;与740Y-P组比较,cP＜0.05;与DHQ 组比较,dP＜0.05。

3.2 DHQ 对IgA 肾病大鼠肾功能的影响

与对照组比较,模型组24 h pro、Scr和BUN 水平升高(P＜0.05);与模型组比较,740Y-P 组24 h pro、Scr和BUN 水平升高,DHQ 组、DHQ+740Y-P组24 h pro、Scr和BUN 水平降低(P＜0.05);与DHQ+740Y-P 组比较,DHQ 组24 h pro、Scr 和BUN 水平降低(P＜0.05)。结果见表2。

表2 DHQ 对IgA肾病大鼠24 h pro、Scr和BUN 水平的影响 ()Tab.2 Effect of dihydroquercetin on the levels of 24 h pro,Scr and BUN in rats with IgA nephropathy ()

注:与对照组比较,aP＜0.05;与模型组比较,bP＜0.05;与740Y-P组比较,cP＜0.05;与DHQ 组比较,dP＜0.05。

3.3 DHQ对IgA肾病大鼠肾脏HE染色结果的影响

对照组大鼠肾小球正常,肾间质未见炎性浸润,几乎无肾小球萎缩;模型组肾小球基底膜增厚,炎性细胞浸润,肾小球萎缩;740Y-P组炎性细胞浸润及肾小球明显萎缩,小血管硬化,较模型组大鼠肾脏病理表现加重;DHQ 组病理损伤减轻,肾小球趋于正常,有少量炎性浸润,较模型组及740Y-P 组改善明显;DHQ+740Y-P组炎性浸润、肾小球萎缩有所改善,但程度远不及DHQ 组。结果见图1。

图1 大鼠肾组织HE染色结果Fig.1 HE staining results of rat kidney tissue

3.4 DHQ 对IgA 肾病大鼠肾纤维化的影响

由表3可知,Masson染色显示对照组大鼠肾内未见明显蓝色胶原蛋白沉积,肾脏无纤维化;模型组、740Y-P组均沉积较多蓝色胶原蛋白,纤维化程度加重,且740Y-P组更为明显;DHQ 组蓝色胶原蛋白沉积最少,肾纤维化程度减轻,而DHQ+740Y-P组蓝色胶原蛋白沉积有所减轻,但纤维化程度高于DHQ 组。由图2可见,与对照组比较,模型组阳性区占观察视野面积比升高(P＜0.05);与模型组比较,740Y-P组面积比升高,DHQ 组、DHQ+740Y-P组面积比降低(P＜0.05);与DHQ+740YP组比较,DHQ 组面积比降低(P＜0.05)。结果见表3、图2。

表3 DHQ 对IgA肾病大鼠胶原纤维阳性区占观察视野面积比和IgA综合密度的影响 ()Tab.3 Effect of dihydroquercetin on the ratio of collagen fiberpositive area to the observation field and the comprehensive density of IgA in rats with IgA nephropathy ()

注:与对照组比较,aP＜0.05;与模型组比较,bP＜0.05;与740Y-P组比较,cP＜0.05;与DHQ 组比较,dP＜0.05。

图2 肾组织Masson染色结果Fig.2 Masson staining results of kidney tissue

3.5 DHQ 对IgA 肾病大鼠直接免疫荧光染色结果与IgA 沉积的影响

由图3可知,对照组大鼠肾内无绿色荧光;模型组、740Y-P组可见大量IgA 绿色荧光沉积,且740Y-P组更甚;DHQ组仅有微量IgA绿色荧光沉积,而DHQ+740Y-P组IgA绿色荧光沉积程度高于DHQ组。由表3可知,与对照组比较,模型组IgA 密度值升高(P＜0.05);与模型组比较,740Y-P组IgA密度值高于模型组,DHQ 组、DHQ+740Y-P组IgA 密度值降低(P＜0.05);与DHQ+740Y-P组比较,DHQ组IgA 密度值降低(P＜0.05)。结果见表3、图3。

图3 肾组织直接免疫荧光染色Fig.3 Direct immunofluorescence staining of kidney tissue

3.6 DHQ 对IgA 肾病大鼠Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K 蛋白表达水平的影响

与对照组比较,模型组p-Akt、p-PI3K 蛋白的表达水平升高(P＜0.05);与模型组比较,740Y-P 组p-Akt和p-PI3K 蛋白的表达水平升高,DHQ 组、DHQ+740Y-P组p-Akt和p-PI3K 蛋白的表达水平降低(P＜0.05);与DHQ+740Y-P组比较,DHQ 组p-Akt和p-PI3K 蛋白的表达水平降低(P＜0.05)。结果见表4、图4。

图4 肾组织Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白的表达水平Fig.4 Akt,p-Akt,PI3K and p-PI3K protein expression in kidney tissue

表4 DHQ 对IgA肾病大鼠Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白表达的影响 ()Tab.4 Effect of dihydroquercetin on the protein expression of Akt,p-Akt,PI3K,and p-PI3K in rats with IgA nephropathy ()

注:与对照组比较,aP＜0.05;与模型组比较,bP＜0.05;与740Y-P组比较,cP＜0.05;与DHQ 组比较,dP＜0.05。

4 讨论

目前研究认为[8]IgAN 的发病与免疫炎症学、遗传学等机制相关,其发病伴随着趋化因子、炎性因子、免疫诱导等的炎症级联反应,引起机体炎症浸润,细胞因子、活性氧等表达量增加,引起系膜区以IgA 为主的复合物沉积[9-10],病情进展下逐渐诱导肾小球硬化与肾间质纤维化,导致肾功能发生不可逆损伤。因此探寻有效药物来阻断、延缓IgAN 病情的进展,或可阻断不可逆损伤的发生,从而改善患者的预后。

DHQ 又称花旗松素,结构特殊,生物效用广泛,抗氧化能力强于普通黄酮类化合物,研究表明,其具有抑制肿瘤、舒张血管、治疗高血压等作用[11-12],且DHQ 还具有抑制细胞增殖、降低炎症水平与氧化应激的作用[13]。有学者将DHQ 应用于糖尿病肾病大鼠,结果显示DHQ 可减轻大鼠模型症状,起到保护肾脏的作用[14]。IgAN是一种炎症性肾脏疾病,机体多种细胞因子表达紊乱,如IL-1β、TNF-α及IL-6等炎性因子持续作用可激发内皮因子释放,引起肾小球系膜增生,肾小球内皮细胞通透性增大,进而使大分子蛋白滤出肾小球,且炎性因子还可影响氮质代谢废物排泄,导致肾功能发生进展性损伤[15],调节炎性因子水平可使肾脏病理损伤减轻[16]。本研究结果显示,模型组血清IL-1β、TNF-α和IL-6 水平以及24 h pro、Scr和BUN 的水平高于对照组,提示IgAN 大鼠血清炎性因子过量表达,肾功能受损,而用DHQ处理后上述血清炎性因子与肾功能指标明显下降,说明DHQ 在减轻IgAN 大鼠炎症反应方面效果确切,可调节肾小球滤过作用,促进Scr、BUN 排出,改善大鼠肾功能。此外,观察HE、Masson、直接免疫荧光染色结果发现,对照组肾小球正常,肾间质未见炎性浸润,肾脏无纤维化,无IgA 绿色荧光沉积,而造模后大鼠肾小球萎缩,肾脏纤维化程度加强,肾内可见大量IgA 绿色荧光沉积,用DHQ 处理后造模大鼠病理情况均有明显改善,说明DHQ 能减少IgA 沉积,减轻炎症因子表达,缓解肾脏纤维化,以改善大鼠肾功能。

PI3K/Akt通路是细胞内重要的信号转导系统,因其能调节细胞骨架、影响细胞迁移而受到重视,其中PI3K 由调节亚基p85与催化亚基p110组成,可接收G 蛋白连接受体传递的信号,Akt是PI3K 下游的直接靶蛋白,接收PI3K 触发的表达信息,磷酸化下游诸多功能蛋白等效应因子,参与细胞凋亡、分化、存活等生理过程的调控,进而调控机体细胞的活性[17-18]。研究发现,PI3K/Akt通路与肾脏缺血再灌注损伤[19]及肾纤维化[20]有关。为明确DHQ 治疗IgAN 大鼠的作用机制,本研究用Western blot检测PI3K/Akt通路及其相关蛋白表达水平的变化,结果发现,模型组p-Akt、p-PI3K 蛋白的表达水平高于对照组,表明IgAN 大鼠机体PI3K/Akt通路异常活化,参与IgAN 病情进展;在造模基础上使用激动剂740Y-P处理,结果显示,740Y-P组p-Akt和p-PI3K蛋白的表达水平高于模型组,表明肾病理损伤越严重,p-Akt 和p-PI3K 蛋白的表达水平越高;而用DHQ 处理后,DHQ 组p-Akt和p-PI3K 蛋白的表达水平明显低于740Y-P组、DHQ+740Y-P组,提示即使在740Y-P抵消DHQ 部分作用的情况下,DHQ 仍可下调p-Akt和p-PI3K 蛋白的表达水平,由此证实DHQ 可抑制PI3K/Akt信号通路相关分子的表达,调节IgAN 大鼠肾功能,改善预后。

综上所述,DHQ 应用于IgAN 大鼠,可降低大鼠血清炎性因子表达水平,明显减少胶原蛋白与IgA沉积,减轻病理损伤,改善大鼠肾功能,这可能与DHQ 抑制PI3K/Akt通路有关,可为后续实验研究及临床治疗提供参考依据。