基于网络药理学方法探讨芪归通络口服液治疗短暂性脑缺血发作的作用机制

黄 金，高 敏

(1.广州中医药大学第五临床医学院，广州 510000； 2.广东省第二中医院脑病科，广州510000)

短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack，TIA)是脑、脊髓或视网膜局灶性缺血所致、未发生急性脑梗死的短暂性神经功能障碍[1]。中国国家卒中登记研究分别于2007年[2]、2012年[3]和2015年[4]基于医院的登记显示，TIA患者占所有以急性脑血管病入院患者的6.20%、8.00%和6.70%。TIA的发病意味着更高的潜在脑卒中风险，研究结果显示，TIA后2 d、7 d、30 d和90 d脑卒中发生概率分别为3.5%、5.2%、8.0%和9.2%[5-6]。积极的早期干预，对防治TIA进展为缺血性脑卒中至关重要，目前对于TIA治疗及二级预防的主流意见均以阿司匹林、氯吡格雷为首选[7-8]。上述两药均有不可忽视的消化系统不良反应，阿司匹林在直接刺激胃黏膜的同时抑制环氧合酶-1，减少前列腺素E2的黏膜保护作用，引起消化道溃疡甚至出血[9]；氯吡格雷抑制内皮生长因子，加重已存在的胃肠道黏膜损伤[10]。

清代医家王清任认为“元气不足”是中风病发生的根本原因，立益气活血法，创补阳还五汤[11]。芪归通络口服液为广东省第二中医院专科特色制剂(批准文号：粤药制字Z20090014)，根据补阳还五汤加减化裁，主要由黄芪、当归、三七、赤芍、丹参、地龙、牛膝和鸡血藤8味药物组成，有补气通络、活血化瘀和强筋骨之效，在临床被广泛用于各类缺血性脑血管的气虚血瘀证，疗效可靠，不良反应少。但其具体机制尚未深入阐明。本研究应用网络药理学方法，试探索芪归通络口服液治疗TIA的可能作用机制，并进行分子模拟对接的初步验证。

1 资料与方法

1.1 化学成分库的构建

利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)[12]、中医药百科全书数据库(ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/)[13]并结合文献检索，收集黄芪、当归、三七、赤芍、丹参、地龙、牛膝和鸡血藤的主要化学成分。

1.2 活性化合物的筛选

中医汤剂以口服为主，选取口服生物利用度(OB)、类药性(DL)对化合物的吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)和排泄(Excretion)性质进行预测，评价其潜在活性[14]。将来自TCMSP数据库的化学成分以OB≥30%、DL≥0.18作为筛选条件[15]；将来自ETCM数据库的化学成分以Druglikeness Grading评分为“Moderate”或“Good”，Druglikeness Weight≥0.5作为筛选标准。

1.3 药物与疾病的靶点收集

通过检索TCMSP、ETCM、DrugBank和PubChem数据库，PubMed、中国知网和万方数据库进行文献挖掘收集，获取药物的潜在靶点。通过GeneCards、人类孟德尔遗传综合数据库获取TIA的疾病靶标。

1.4 活性成分-作用靶点网络构建和分析

利用Cytoscape 3.7.0软件[16]构建中药复方-单味药-活性成分-作用靶点-疾病靶标网络模型，利用Network Analyzer功能获得的度值和中介度等参数对模型进行分析。使用Cytoscape中的Generate style from statistics工具将节点大小、边的粗细与度值、Combine score大小相适应。

1.5 靶点相互作用网络

STRING数据库(https://string-db.org/, Version 11.0)[17]基于多种数据来源和证据，收录丰富的蛋白质及其相互作用信息。将获取的药物-疾病共同靶点导入STRING数据库，得到蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)信息，导出为TSV格式，输入Cytoscape软件绘制PPI网络，并进行分析。

1.6 靶点的分子功能/生物过程和通路富集分析

使用WebGestalt在线工具(http://www.webgestalt.org/)[18]进行基因本体(GO)功能富集分析。选择物种为“homo sapiens”，采用Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)富集分析算法，分别对生物学过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组成(CC)进行GO富集分析，并绘制柱状图。将筛选得到的交集靶点输入DAVID 6.8数据库中进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。

1.7 分子对接

选取活性成分-作用靶点网络中度值较大的活性成分与蛋白靶点进行初步的分子对接验证。从TCMSP数据库下载小分子的mol文件，于PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获取蛋白的PDB文件。使用Autodock 4.2.6软件[19]进行蛋白-分子对接，利用Pymol 2.2软件对蛋白进行除氢、去水和去除小分子配体等预处理以及对接结果的可视化展示。

2 结果

2.1 芪归通络口服液中的活性成分及对应的潜在靶点信息

经TCMSP数据库、ETCM数据库以及相关文献检索查找，去除重复项，共获取芪归通络口服液全方符合条件的化学成分：黄芪49种，当归48种，赤芍32种，牛膝23种，丹参114种，鸡血藤41种，三七32种，地龙8种，共347种化学成分。进一步得到潜在靶点403个，疾病靶标218个。绘制韦恩图，见图1。芪归通络口服液、TIA交集得到40个重合靶点，即药物-疾病共同靶点。

图1 药物与疾病靶点基因交集韦恩图

2.2 活性成分-作用靶点网络构建和分析

利用Cytoscape 3.7.0软件构建中药复方-单味药-活性成分-作用靶点-疾病靶标网络，共137个节点，357条边，见图2。六边形节点表示芪归通络口服液整体复方，八边形节点表示疾病TIA，正方形节点表示各中药组成，平行四边形节点表示中药所含化学成分，圆形节点表示药物-疾病共同靶点，并依次相互连接。节点度值表示节点在网络中的连接度[20]。本网络中，度值较高的节点，中药有丹参(30)、黄芪(17)和当归(14)；化合物有槲皮素(quercetin)(33)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)(14)、木犀草素(luteolin)(12)和大豆苷元(daidzein)(10)；靶点有雌激素受体1(ESR1)(56)、胱天蛋白酶3(CASP3)(22)、凝血因子7(F7)(10)、血管内皮生长因子A(VEGFA)(10)和白细胞介素6(IL-6)(10)。

2.3 药物-靶点-疾病相互作用网络构建与分析

通过Cytoscape软件绘制PPI网络，见图3。图中共包含40个节点，245个边，节点平均度值为12.2，平均局部聚类系数为0.637，PPI富集均值<1.0×10-16。

图2 芪归通络口服液单味药-活性成分-作用靶点-疾病相互作用网络

2.4 预测作用靶点的GO功能富集分析

经WebGestalt分析平台对潜在作用靶点进行GO功能富集分析，绘制柱状图，见图4。其中，BP相关主要涉及刺激反应、生物调节、定位和细胞信号传导等；MF相关主要涉及蛋白质结合、离子结合、水解酶活性、分子转导活性和酶调节活性等；CC相关主要涉及细胞膜、囊泡、蛋白质复合体、内膜系统、膜封闭腔和细胞外间隙等。结果提示，芪归通络口服液治疗TIA相关的关键靶标可能与细胞信号转导、细胞膜和调节酶的活性等BP有一定关系。

A.BP；B.CC；C.MFA.BP；B.CC；C.MF

2.5 KEGG通路富集分析结果

通过KEGG通路富集分析，获取芪归通络口服液治疗TIA相关的通路，得到P<0.05的信号通路77条，以Count值降序筛选处排序居前20位的KEGG通路输出柱形图和气泡图。结果提示，关键基因靶点主要涉及糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications)、缺氧诱导因子-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、血小板激活(platelet activation)和流体剪切力与动脉粥样硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)等，见图5。

图3 芪归通络口服液靶点相互作用网络

2.6 分子对接结果

图2中节点度值较高的活性成分有槲皮素、木犀草素和大豆苷元，核心靶点蛋白包括CASP3、VEGFA和IL-6，分别进行分子对接验证，结果见表1。并进行分子对接模式图展示，见图6。结果显示，各活性成分与蛋白对接的结合自由能均<-20.93 kJ/mol，有较高的亲和力[21]。

A.IL-6与大豆苷元对接图；B.VEGFA与大豆苷元对接图；C.CASP3与大豆苷元对接图；D.IL-6与木犀草素对接图；E.VEGFA与木犀草素对接图；F.CASP3与木犀草素对接图；G.IL-6与槲皮素对接图；H.VEGFA与槲皮素对接图；I.CASP3与槲皮素对接图A. docking diagram of IL-6 and daidzein; B. docking diagram of VEGEFA and daidzein; C. docking diagram of CASP3 and daidzein; D. docking diagram of IL-6 and luteolin; E. docking diagram of VEGFA and luteolin; F. docking diagram of CASP3 and luteolin; G. docking diagram of IL-6 and quercetin; H. docking diagram of VEGEFA and quercetin; I. docking diagram of CASP3 and quercetin

表1 主要活性成分与疾病靶点的分子对接结果

3 讨论

本研究进行了“中药-活性成分-靶点”关系网络的构建及多层次功能分析，结果提示，芪归通络口服液中蚓激酶(earthworm fibrinolytic enzyme)、槲皮素、木犀草素、大豆苷元、丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA)和丹酚酸A(salvianolic acid A)等为芪归通络口服液全方的主要活性成分；ESR1、CASP3、F7、VEGFA、纤溶酶原(PLG)和P2Y嘌呤受体12等靶标作用于HIF-1、Platelet activation、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)等信号通路是干预TIA的关键路径。

图5 芪归通络口服液治疗TIA潜在核心靶点的KEGG通路富集分析

文献统计结果显示，中风病气虚血瘀证的用药中，地龙的使用频次高居第3位，与当归并列，可见其独特作用[22]。地龙药用历史悠久，《神农本草经》[23]中已有记载，《滇南本草》[24]谓其“味苦、辛，性寒。祛风。治……口眼歪斜”。清代医家叶天士指出，虫类药“飞者升，走者降，灵动迅速，追拔沉混气血之邪”[25]，非普通草木、矿石之药所能及。药理学研究结果显示，地龙富含脂类[26]、蛋白质[27]、酶类、氨基酸[28]、微量元素[29]和核苷酸[30]等成分，其中蚓激酶在治疗脑血管病中起到核心作用。蚓激酶具有纤溶酶活性，有组织纤溶酶原激活物和抗纤溶酶原激活物抑制剂样作用，能通过激活纤溶酶原，产生降解纤维蛋白和纤维蛋白原的纤溶酶[31]；另一方面，能增加组织间其他纤维蛋白溶酶原激活物的活性，抑制凝血途径[32]。《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》[33]推荐，血浆纤维蛋白原和血液黏滞度升高的缺血性脑血管病患者使用蚓激酶进行降纤治疗。本研究的药物-靶点相互作用网络显示，蚓激酶作用于PLG靶点，在一定程度上阐释了虫类药“通经达络，搜剔疏利”独特功效的药理学内在机制。槲皮素为三七、黄芪和牛膝的共有成分，作用于CASP3、F7、VEGFA、IL-6、ALOX5和NOS3等多个靶点。槲皮素通过下调CD80、CD86、MHC-Ⅱ、IL-6和IL-12的表达，降低刺激T细胞异基因增殖的能力，并上调Dabs蛋白表达，抑制树突细胞成熟，从而下调SRC/PI3K/Akt/核因子κB炎症途径来抑制炎症反应和AS的形成[34]。

ESR1是本网络构建中最高节点度值的靶点，大量活性成分作用与该靶点相互作用。ESR1作为经典核受体，与神经系统和内分泌系统活动相关，调控靶基因的转录而发挥“基因型”调节效应[35]。研究结果表明，雌激素通过拮抗兴奋性氨基酸毒性[36]、抗氧化应激[37]、增加脑部血流量[38]、抑制凋亡通路[39-40]和抑制动脉粥样硬化[41]等多个过程参与调节缺血性脑卒中的发生。芪归通络口服液全方共52种成分作用于ESR1靶点，其中大豆苷元[42]、丹参酮ⅡA[43]等代表性雌激素成分，起到防治脑血管病的重要作用。

KEGG通路富集结果显示，在HIF-1、Platelet activation等信号通路上有较高的富集程度。缺氧是神经细胞低灌注下的损伤机制之一。HIF在缺氧应激条件下充当许多缺氧诱导基因的主要调节因子，通过快速调节氧依赖性信号传导级联和下游基因的活化，调节细胞内能量利用水平，以改善缺血性疾病中代谢的变化[44]。缺氧条件下，经上游的mTOR、丝裂原激活的蛋白激酶和PI3K-Akt多个信号通路作用，激活HIF-1α转录因子，调节下游的VEGF信号通路，阻断细胞凋亡[45]，并对神经有直接保护作用[46]；同时激活iNOS、eNOS，使血管平滑肌松弛，降低血压，并改善局部脑组织再灌注[47]。抗血小板治疗是目前防治TIA的一线选择，本研究结果显示，芪归通络口服液全方在Platelet activation信号通路上富集的有P2Y12、PI3K、Akt、F2和eNOS等靶点。PI3K/AKT通路是诱导血小板颗粒释放、激活及黏附的上游信号放大途径之一。PI3K家族中，PI3Kβ、PI3Ky在血小板信号转导中起着关键作用[48]；PI3K的激活可致血小板内Akt的主要亚型Akt-1和Akt-2磷酸化，进一步激活下游eNOS等靶点，介导血小板激活过程[49]。丹参中有效成分丹酚酸A，即通过该信号通路有效抑制下游分子Akt的磷酸化，降低血小板激活[50]。

综上所述，本研究应用网络药理学方法探讨了芪归通络口服液对TIA的潜在作用机制，采用分子模拟对接进行了初步验证，为芪归通络口服液多成分、多靶点、多通路综合防治TIA的可能作用机制提供了参考，为后续更深入、切实的实验验证研究提供了一定的理论方向。