核桃青皮提取物对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK信号通路的影响Δ

2022-08-03张硕稳杜志兴庞建民李瑞池刘永建郑丽华

中国医院用药评价与分析 2022年6期

张硕稳，李丹，贺静，杜志兴，庞建民，李瑞池，刘永建#，郑丽华

(1.河北医科大学第一医院健康管理中心，石家庄 050000； 2.河北医科大学第一医院普外科，石家庄 050000)

乳腺癌是一种异质性疾病，被认为是世界女性中发病率和病死率较高的一种恶性肿瘤[1]。根据国际癌症研究机构2018年发布的全球统计数据，乳腺癌的发病患者占所有恶性肿瘤的11.6%，乳腺癌为仅次于肺癌的全球第二大常见恶性肿瘤[2]。尽管在诊断和联合治疗方面取得了进步，但乳腺癌患者的预后仍然不令人满意[3]。近年来，随着中医药的快速发展，越来越多的天然产物被发现具有抗肿瘤作用[4]。据研究报道，核桃青皮中具有多种药理活性成分，如核桃多糖、胡桃醌和鞣花酸等，具有抗菌、镇痛和抑癌等功效[5-6]。高杨等[7]的研究结果表明，核桃青皮提取物可显著抑制胃癌细胞的增殖和转移，可能是胃癌预防的潜在治疗药物。然而，核桃青皮提取物在乳腺癌中是否有相同的功效还未可知。表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路为细胞中重要的调控机制，且已证实抑制EGFR/MAPK通路可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡[8]。推测核桃青皮提取物可能通过抑制EGFR/MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。为验证该猜想，进行了以下研究，以期为乳腺癌的治疗提供帮助。

1 材料

1.1 实验细胞

人乳腺癌MCF-7细胞(批号为CM-H061)，购自美国模式培养物保藏中心(ATCC)。

1.2 仪器

LT-CIX90型CO2细胞培养箱、DG5031型酶标仪，均购自上海立德泰勀科学仪器有限公司；M205FA型显微镜、Attune NxT型流式细胞仪、GIS-300型凝胶成像系统，均购自北京昊诺斯科技有限公司。

1.3 药品与试剂

核桃青皮提取物(原料药，纯度≥98%，批号为WJ-6013R)购自西安四叶草生物科技有限公司；盐酸阿霉素(原料药，纯度99%，批号为25219-27，实验时用完全培养液稀释成浓度为0.01 mg/mL)购自山东永信中和生物科技有限公司；DEME培养基(批号为LM-P0523)、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)增殖检测试剂盒(批号为LM-K0149)，均购自上海联迈生物公司；EGFR激动剂(NSC228155，批号为HY-10142)购自美国MedChemExpress公司；TUNEL红色荧光原位凋亡检测试剂盒(批号为A209-11)、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(批号为A315-14)，均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；高效RIPA细胞快速缓冲液(批号为R4512)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号为PC01595)和ECL超敏发光液(批号为PE0615-28)，均购自北京索莱宝科技有限公司；鼠抗人细胞周期蛋白D1(CyclinD1，批号为ab170099)、增殖细胞核抗原(PCNA，批号为ab52894)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2，批号为ab40815)、Bcl-2相关X蛋白(Bax，批号为ab201015)、EGFR(批号为ab32503)、磷酸化EGFR(p-EGFR，批号为ab219584)、胞外信号调节激酶(ERK，批号为ab92552)、磷酸化ERK(p-ERK，批号为ab182858)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK，批号为ab179461)、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK，批号为ab184699)、c-Jun氨基端蛋白激酶(JNK，批号为ab16713)、磷酸化JNK(p-JNK，批号为ab60124)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，批号为ab00129)单克隆抗体、鼠抗人二抗(批号为ab00258)，均购自美国Abcam公司。

2 方法

2.1 细胞培养

乳腺癌MCF-7细胞在含10%胎牛血清的DEME培养基中培养，培养条件为37 ℃、5%CO2的湿润培养箱，至细胞融合度>70%，进行传代培养，选择传3代对数期生长的细胞进行后续研究。

2.2 CCK-8检测不同浓度核桃青皮提取物对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

将对数期生长的乳腺癌MCF-7细胞接种于96孔板中(5×103个/孔)，待细胞贴壁生长后，更换为含不同浓度梯度的核桃青皮提取物(0、5、10、20、40和80 μg/mL)的培养基培养48 h。依次向每孔中添加CCK-8溶液10 μL，继续培养2 h后使用酶标仪检测各孔乳腺癌MCF-7细胞在450 nm波长处的吸光度(OD)，计算细胞增殖率。细胞增殖率=OD实验组/OD对照组×100%，实验组为不同浓度梯度的核桃青皮提取物组，对照组为0 μg/mL核桃青皮提取物组。各组均设6个平行样。

2.3 细胞分组

将对数期生长的乳腺癌MCF-7细胞依次分为空白对照组、阳性对照组、核桃青皮提取物低浓度组、核桃青皮提取物高浓度组和核桃青皮提取物高浓度+NSC228155组。空白对照组细胞不进行任何处理，正常培养48 h；阳性对照组细胞使用含0.01 mg/mL盐酸阿霉素[9]的培养基培养48 h；核桃青皮提取物低、高浓度组细胞分别使用含20、40 μg/mL核桃青皮提取物的培养基培养48 h；核桃青皮提取物高浓度+NSC228155组细胞使用含40 μg/mL核桃青皮提取物和100 μmol/L NSC228155[10]的培养基培养48 h。各组均设6个平行样。通过“2.2”项下方法，采用CCK-8检测各组乳腺癌MCF-7细胞增殖情况。

2.4 集落形成实验检测各组乳腺癌MCF-7细胞集落形成数量

将经过“2.3”项下方法处理的各组乳腺癌MCF-7细胞接种于培养皿中(1×102个/皿)，以十字线方向轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分散。将培养皿置于培养箱中培养2～3周，期间根据培养基pH变化更换培养基；直至出现肉眼可见的克隆时，中止培养。吸出培养基后干燥。添加甲醇固定15 min，后使用Giemsa染色10 min，轻轻冲洗掉染色液，干燥后于显微镜中拍照并对>50个细胞克隆数的集落进行计数。

2.5 TUNEL法检测各组乳腺癌MCF-7细胞凋亡水平

将经过“2.3”项下方法处理的各组乳腺癌MCF-7细胞制备形成5×107个/mL的悬浮液，吸取100 μL接种至细胞爬片上，待爬满细胞后使用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻冲洗细胞，添加甲醇固定15 min。之后严格按照TUNEL红色荧光原位凋亡检测试剂盒说明进行操作。在显微镜下观察，并统计凋亡细胞数量，TUNEL阳性细胞率=每个视野中凋亡细胞数/总细胞数×100%。

2.6 流式细胞仪检测各组乳腺癌MCF-7细胞凋亡率

将经过“2.3”项下方法处理的各组乳腺癌MCF-7细胞接种于6孔细胞培养板中(1×105个/孔)，培养24 h，使用PBS洗涤细胞，将细胞悬浮于结合缓冲液中，并添加Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)各5 μL，于4 ℃下避光孵育30 min，使用结合缓冲液洗涤3次以去除多余的染料，后重悬于500 μL的结合缓冲液中，在1 h内使用流式细胞仪分析各组乳腺癌MCF-7细胞的凋亡率。

2.7 蛋白免疫印迹法检测各组乳腺癌MCF-7细胞中增殖、凋亡及EGFR/MAPK信号通路相关蛋白的表达水平

使用高效RIPA细胞快速缓冲液提取按照“2.3”项下方法处理的各组乳腺癌MCF-7细胞总蛋白，经BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。通过电泳分离蛋白，然后转移至聚偏氟乙烯膜上，使用TBST配制的5%牛血清白蛋白封闭1 h，将聚偏氟乙烯膜与CyclinD1、PCNA、Bax、Bcl-2、p-EGFR、EGFR、p-ERK、ERK、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK和GAPDH一抗(均为1∶1 000)在4 ℃下孵育过夜。隔日洗膜3次后添加鼠抗人二抗(1∶3 000)室温(25 ℃)孵育1 h。最后，使用ECL超敏发光液可视化免疫印迹，采用Image J软件分析蛋白质印迹的灰度值。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 不同浓度核桃青皮提取物对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

使用不同浓度核桃青皮提取物干预乳腺癌MCF-7细胞，结果显示，当核桃青皮提取物浓度<20 μg/mL时，各浓度下细胞增殖率的差异均无统计学意义(P>0.05)；当核桃青皮提取物浓度≥20 μg/mL时，细胞增殖率显著降低，与0 μg/mL比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。故选择20、40 μg/mL分别为低、高浓度核桃青皮提取物处理浓度。

表1 不同浓度的核桃青皮提取物对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

3.2 各组乳腺癌MCF-7细胞增殖率和集落形成数量比较

与空白对照组相比，阳性对照组、核桃青皮提取物低浓度组和高浓度组细胞增殖率、细胞集落形成数量均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组相比，核桃青皮提取物低浓度组细胞增殖率、集落形成数量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；而核桃青皮提取物高浓度组细胞增殖率、集落形成数量与阳性对照组的差异无统计学意义(P>0.05)；与核桃青皮提取物低浓度组相比，核桃青皮提取物高浓度组细胞增殖率、集落形成数量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与核桃青皮提取物高浓度组相比，核桃青皮提取物高浓度+NSC228155组细胞增殖率、集落形成数量升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表2。

A.空白对照组；B.阳性对照组；C.核桃青皮提取物低浓度组；D.核桃青皮提取物高浓度组；E.核桃青皮提取物高浓度+NSC228155组A.blank control group; B.positive control group; C.walnut green husk extract low concentration group; D.walnut green husk extract high concentration group; E.walnut green husk extract high concentration+NSC228155 group

表2 五组乳腺癌MCF-7细胞增殖率和集落形成数量比较

3.3 各组乳腺癌MCF-7细胞凋亡情况比较

与空白对照组相比，阳性对照组、核桃青皮提取物低浓度组和高浓度组TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组相比，核桃青皮提取物低浓度组TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而核桃青皮提取物高浓度组TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率与阳性对照组的差异无统计学意义(P>0.05)；与核桃青皮提取物低浓度组相比，核桃青皮提取物高浓度组TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与核桃青皮提取物高浓度组相比，核桃青皮提取物高浓度+NSC228155组TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2—3、表3。

表3 五组乳腺癌MCF-7细胞TUNEL阳性细胞率和细胞凋亡率比较

3.4 各组乳腺癌MCF-7细胞中增殖、凋亡相关蛋白表达水平比较

与空白对照组相比，阳性对照组、核桃青皮提取物低浓度组和高浓度组乳腺癌MCF-7细胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组相比，核桃青皮提取物低浓度组乳腺癌MCF-7细胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；而核桃青皮提取物高浓度组乳腺癌MCF-7细胞中CyclinD1、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表达水平与阳性对照组的差异均无统计学意义(P>0.05)；与核桃青皮提取物低浓度组相比，核桃青皮提取物高浓度组乳腺癌MCF-7细胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与核桃青皮提取物高浓度组相比，核桃青皮提取物高浓度+NSC228155组乳腺癌MCF-7细胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4—5。

与空白对照组比较，aP<0.05；与阳性对照组比较，bP<0.05；与核桃青皮提取物低浓度组比较，cP<0.05；与核桃青皮提取物高浓度组比较，dP<0.05Note: vs. the blank control group, aP<0.05; vs. the positive control group, bP<0.05; vs. the walnut green husk extract low concentration group, cP<0.05; vs. the walnut green husk extract high concentration group, dP<0.05

3.5 各组乳腺癌MCF-7细胞中EGFR/MAPK信号通路相关蛋白表达水平比较

与空白对照组相比，阳性对照组、核桃青皮提取物低浓度组和高浓度组乳腺癌MCF-7细胞中p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组相比，核桃青皮提取物低浓度组乳腺癌MCF-7细胞中p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；而核桃青皮提取物高浓度组乳腺癌MCF-7细胞中p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值与阳性对照组的差异均无统计学意义(P>0.05)；与核桃青皮提取物低浓度组相比，核桃青皮提取物高浓度组乳腺癌MCF-7细胞中p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与核桃青皮提取物高浓度组相比，核桃青皮提取物高浓度+NSC228155组p-EGFR/EGFR、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-JNK/JNK蛋白比值升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图6—7。

4 讨论

核桃青皮中富含多种生物活性成分，如胡桃醌可抑制卵巢癌细胞增殖、转移并诱导其凋亡，抗肿瘤效果较好[11]；核桃青皮提取物对包括胃癌[7]、肺癌[12]在内的多种恶性肿瘤具有一定的抑制作用。本研究通过使用不同浓度的核桃青皮提取物干预乳腺癌MCF-7细胞，筛选出合适的核桃青皮提取物处理浓度。经对核桃青皮提取物干预后的乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡检测发现，核桃青皮提取物可明显降低乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力，提高细胞凋亡能力，且随着核桃青皮提取物浓度的升高，其影响作用也随之增加。该结果表明，核桃青皮提取物可能通过抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、诱导细胞凋亡，进而发挥抑癌作用。为验证该结果，本研究添加临床抗肿瘤药盐酸阿霉素作为阳性对照，结果发现，低浓度的核桃青皮提取物对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的作用小于盐酸阿霉素，高浓度的核桃青皮提取物对乳腺癌MCF-7增殖、凋亡的作用与盐酸阿霉素相当，表明在乳腺癌MCF-7细胞中，高浓度的核桃青皮提取物与盐酸阿霉素的功效类似，均具有抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、促进细胞凋亡的作用，但其如何在乳腺癌MCF-7细胞中发挥作用，还未可知。

MAPK信号通路已被认为是抗恶性肿瘤治疗的有效级联通路，MAPK为丝氨酸/苏氨酸激酶，将其特定底物磷酸化为丝氨酸和(或)苏氨酸残基，以调节基因表达、有丝分裂、增殖、运动、代谢和程序性细胞凋亡[13]。MAPK通路具有3个亚通路，包括ERK、JNK和p38 MAPK亚通路，据报道，ERK通路对细胞存活很重要，而JNK和p38 MAPK则与细胞的凋亡相关[14]。已有研究结果证实，阻断p38 MAPK通路可在一定程度上减少白细胞介素32诱导的上皮间充质转化标志物的表达和乳腺癌细胞的侵袭及转移[15]。此外，调节细胞存活/死亡的途径还涉及EGFR通路，EGFR为受体酪氨酸激酶，通过各种下游信号通路被激活以促进细胞增殖、运动和存活[16]；且已有研究结果证实，EGFR为三阴性乳腺癌治疗的靶点[17]。因此，抑制EGFR/MAPK通路可能是治疗乳腺癌的一种新策略。本研究结果发现，低浓度和高浓度的核桃青皮提取物可下调EGFR、ERK、p38 MAPK和JNK的磷酸化水平，表明核桃青皮提取物可能通过抑制EGFR/MAPK通路抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。同时，添加EGFR通路激动剂可有效逆转核桃青皮提取物对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路的影响。此外，本研究结果亦发现，核桃青皮提取物可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞中CyclinD1、PCNA和Bcl-2蛋白表达，促进Bax蛋白表达。已知CyclinD1、PCNA是与增殖相关的蛋白，二者的表达水平可在一定程度上反映细胞的增殖能力；Bcl-2和Bax为凋亡过程中的一对关键因子，上调Bax水平、下调Bcl-2水平可有效促进细胞凋亡[18]。以上结果表明，核桃青皮提取物通过抑制EGFR/MAPK通路调控增殖、凋亡相关蛋白水平，从而抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，促进细胞凋亡。

综上所述，核桃青皮提取物通过抑制EGFR/MAPK信号通路对乳腺癌MCF-7细胞发挥抑制其增殖、促进其凋亡的作用，并可能与调控增殖、凋亡相关蛋白有关，为乳腺癌的预防和治疗提供了新的思路。但本研究并未探究是否还有其他通路参与核桃青皮提取物对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的作用，以及EGFR/MAPK信号通路是否直接调控增殖、凋亡相关的蛋白发挥作用，后续将从这两个方向重点探究，以完善核桃青皮提取物的功效。