复合藻对D-半乳糖诱导小鼠衰老模型皮肤屏障功能的改善作用

时间、激素、饮食、环境污染及太阳辐射等均可导致皮肤老化现象的发生

。真皮胶原细胞外基质是维持皮肤力量和弹性的主要功能组织

。胶原蛋白（Collagen）超家族一共被划分为8个家族，28种不同类型的胶原蛋白

，其中皮肤内部Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白最丰富，它们是皮肤真皮层细胞外最主要的基质（ECM）。Ⅰ型胶原占皮肤ECM的80%～85%，而Ⅲ型胶原占8%～11%

。

海洋大型藻类富含大量生物活性物质，其在中医中早已用于皮肤疾病的治疗，具有抗氧化、抗炎、抗菌及抗过敏等作用

。课题组通过开发一种由褐藻（海带、墨角藻、巨藻）及小球藻以适宜比例组成的复合藻，发现其可以通过上调Sirt3表达，促进线粒体能量代谢水平，改善紫外线诱导的皮肤光老化

，但是该复合藻在对皮肤胶原蛋白含量及其修复皮肤屏障功能中的研究尚未明确，因此本研究通过采用D-半乳糖诱导小鼠皮肤衰老及D-半乳糖刺激的小鼠原代皮肤成纤维细胞损伤模型考察复合藻对小鼠皮肤胶原蛋白及其屏障功能的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂：复合藻提取物[褐藻（海带、墨角藻、巨藻）及小球藻混合组成，成都丁因科技有限公司]；Sirt3抗体（abcom，美国）；Nrf2抗体（abcom，美国）；GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

此外，邢孟志[14]从文字学、金石学视角出发提出，清初文字学、金石学家的研究，促使清代碑学运动自清早期开始萌芽，中期以阮元、包世臣为代表。扫尽帖学低眉柔靡之风、倡导碑学质朴雄强面貌的学术运动，仍是在篆隶书的领域展开的，而清代篆隶的复兴正是文字学、金石学研究的结果。碑学运动也是受文字学、金石学直接影响的产物，这一影响带来了书法理论和书法创作上审美取向的根本改变，这一改变丰富了书法创作的理论内容，拓展了书法创作的空间。

1.2 仪器：二氧化碳培养箱(Sigma，公司)；生物洁净工作台(苏州安泰空气有限公司)；多功能酶标仪（Tecan Mpro200，瑞士），Western blot电泳及化学成像系统（Bio-red，美国）。

路基两侧需要进行加宽处理，方式为拼接，控制加宽宽度约为4.5 m。在对路基加宽处理时，首先将外围车道进行封堵，然后开始加宽部分的施工，在路基加宽施工期间，为了不给交通带来太大的压力，极可能保持双向车道可以通车，施工过程如图2所示。

2.1 复合藻对D-半乳糖诱导的小鼠皮肤衰老模型含水量的影响：D-半乳糖干预可以导致小鼠皮肤水分发生明显损失，在造模的第8周模型组小鼠皮肤与正常对照组比较差异有统计学意义（

＜0.05）；复合藻干预后，小鼠皮肤水分损失现象有降低趋势，在第8周复合藻高剂量组与模型组比较差异有统计学意义（

＜0.05）。见图1。

1.3.2 小鼠皮肤水分测定：采用皮肤水分测试仪在建模及给药干预完成后分别测定各组小鼠皮肤水含量，监测小鼠皮肤含水变化。

马克思主义认为，社会作为一个有机体是由多个子系统集成的，社会整体观要求我们看到整体联动的优越性，要求我们确立整体大于部分观念。习近平指出，共产党人的初心就是为了实现人民的根本利益，就是要坚持以人民为中心的发展思想，这也是对社会各子系统运行的总规范。具体说来要把握好以下三个理念：

1.3.3 小鼠皮肤组织生化指标测定：建模及给药干预完成后，处死小鼠，取100 mg小鼠背部皮肤，并除去皮下脂肪和结缔组织，加入生理盐水匀浆后，4℃、3 000 r/ min条件下离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明检测皮肤组织中羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）、透明质酸（Hyaluronic acid，HA）及皮肤总蛋白含量。

1.3 方法

2.2 复合藻对小鼠皮肤中羟脯氨酸、透明质酸含量的影响：模型组小鼠皮肤中羟脯氨酸、透明质酸含量均显著降低，与正常对照组比较差异具有统计学意义（

＜0.05）；中、高剂量复合藻干预可以明显升高小鼠皮肤羟脯氨酸含量，高剂量复合藻干预可升高透明质酸的含量，且与模型组比较差异均具有统计学意义（

＜0.05）。因此给予D-半乳糖可以明显降低小鼠皮肤羟脯氨酸、透明质酸含量，而复合藻干预后可以明显抑制D-半乳糖导致的小鼠皮肤羟脯氨酸、透明质酸的丢失，升高小鼠皮肤中羟脯氨酸、透明质酸含量。见图2。

1.3.5 D-半乳糖诱导小鼠皮肤成纤维细胞衰老模型的建立：采用5～7 d昆明乳鼠的背部皮肤，Ⅰ型胶原酶消化法分离获得小鼠皮肤成纤维细胞。细胞培养于二氧化碳孵育箱中，采用高糖DMEM培养基培养。采用D-半乳糖（20 g/L）的培养基，刺激建立成纤维细胞衰老模型。模型建立的同时给予复合藻提取物干预，复合藻的浓度为5、25、50 μM。细胞板离心后收集上清液，细胞中每孔加入200 μl 1%的Triton-X 100裂解液，4℃放置30 min后，分别收集至96孔板中，根据ELISA试剂盒说明书分别检测Ⅰ型（COL1A2）、Ⅲ型胶原蛋白（COL3A1）和纤连蛋白的表达量（E）。相对表达倍数计算公式为：相对表达倍数=E

/E

。

1.3.6 实时定量PCR：实时定量PCR检测细胞中的mRNA表达。用Trizol常规方法提取总RNA。采用紫外分光光度计检测OD

/OD

，将1μg总RNA采用逆转录试剂盒反转录成20 μl cDNA。采用RocheR FastStart Essential DNA Green Master进行实时定量，扩增反应引物（见表1）。扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，40个循环。溶解曲线分析表明PCR反应产物为单独的双链DNA。用2

值法，以β-actin表达为内参定量其他mRNA的表达。

南宋周密《武林旧事》的记录更有意思了，“小经纪”逐条罗列了杭州城的各种小商品与宠物服务，其中有“猫窝、猫鱼、卖猫儿、改猫犬”，猫窝、猫鱼、卖猫儿的含义好理解，“改猫犬”很可能是给宠物猫、宠物犬做美容。《宋史·孝义传》记载，“江州德安陈昉”之家，“有犬百余，共食一槽，一犬不至，群犬不食”。养了一百多条狗，恐怕就不单纯是出于实用目的，而应该对狗有特别的感情。又据洪迈《夷坚志》，宋人员琦，“养狗黑身而白足，名为‘银蹄’，随呼拜跪，甚可爱。忽失之，揭榜募赎”。这条“甚可爱”的小狗，有名字，有一日丢失了，主人还贴出启事，悬赏寻狗，显然员家已将“银蹄”当成宠物来饲养了。

2.市场化风险合作承包模式。在现有技术、经济、政策下开发无效益甚至负效益的难采储量区块，大港油田提出了在中国石油内部开展市场化风险合作承包的策略，得到中石油集团公司的认可。在严格执行中国石油“油气田开发管理规定”和矿权归属不变的前提下，邀请渤海钻探、长城钻探、大港油田集团公司3 家企业参加6 个难采储量区块的开发竞标。通过竞标，与渤海钻探工程有限公司、长城钻探工程有限公司、大港油田集团有限责任公司3 家企业签订了滨海一区、塘沽-长芦、叶三拨等6个风险区块的开发协议。生产期间，全部油气产量归甲方所有，由甲方按照中国石油相关规定向乙方支付服务费。

2 结果

1.3.1 D-半乳糖诱导的皮肤衰老模型及动物分组：采用18～22 g昆明种小鼠50只，将小鼠随机分为5组，分别为正常对照组、模型组、复合藻低剂量组（0.25 g/kg）、复合藻中剂量组（0.5 g/kg）及复合藻高剂量组（1 g/kg）。复合藻提取物浓度按照前期预实验剂量给予。正常对照组皮下注射生理盐水，其余各组小鼠每天1次皮下注射D-半乳糖（1 g/kg），连续8周，建立亚急性皮肤衰老小鼠模型。在开始注射D-半乳糖4周后，复合藻干预组各组动物皮肤涂抹相应复合藻，每天1次，连续4周。

1.3.4 小鼠皮肤胶原蛋白和纤连蛋白含量检测：取100 mg小鼠背部皮肤，并除去皮下脂肪和结缔组织，加入生理盐水匀浆后，4℃、3 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和纤连蛋白的表达量（E）。相对表达倍数计算公式为：相对表达倍数=EPTC溶液/E阴性对照。

2.3 复合藻对小鼠皮肤组织老化的影响：正常对照组小鼠皮肤结构完整，真皮层较厚，基底膜可见，毛囊、皮脂腺可见。模型组小鼠皮肤结构紊乱，真皮层显著变薄，细胞数减少，基底膜不清晰。低、中剂量组小鼠皮肤结构有所改善，皮肤略增厚，真皮层厚度有所恢复，染色较均匀，细胞层数增多；基底膜可见。高剂量组小鼠皮肤结构基本恢复，表皮与真皮界线清晰、规则，染色较均匀，真皮层厚度明显增加。见图3。

1.3.7 Western印迹法分析蛋白表达情况：各组细胞转染48 h后,磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，每孔加入蛋白裂解液后，反复吹打，使细胞充分裂解，95℃～100℃煮沸10 min，10 000 r/min离心10 min，收集的上清液即为样本蛋白。顺序加样，待电泳分离完全后，采用湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，TBST充分洗膜后加入特异性一抗GAPDH（1:10 000稀释）及COL1A1和COL3A1抗体（1:1 000稀释）。4℃过夜孵育，二抗（1:10 000稀释）室温孵育1 h，充分洗膜后加电化学发光（ECL）液显影，凝胶成像仪自动曝光，并分析灰度值，每个样本重复3次。

2.4 复合藻对小鼠皮肤COLⅠ﹑COL Ⅲ和纤连蛋白含量的影响：D-半乳糖可以导致小鼠皮肤中屏障功能相关蛋白COLⅠ﹑COL Ⅲ和纤连蛋白的含量明显减少，模型组与正常对照组比较差异具有统计学意义（

＜0.05）；而给予复合藻干预后，小鼠皮肤中COLⅠ﹑COL Ⅲ和纤连蛋白含量明显升高，且高剂量组与模型组比较差异具有统计学意义（

＜0.05）。见图4。

2.5 复合藻对D-半乳糖诱导小鼠皮肤成纤维细胞衰老模型中成纤维细胞活力的影响：D-半乳糖可以导致成纤维细胞活力显著降低，模型组与正常对照组比较差异具有统计学意义（

＜0.05）；给予复合藻干预后，显著改善了D-半乳糖诱导的小鼠皮肤成纤维细胞损伤，提高了细胞活力，且中、高剂量组与模型组比较差异具有统计学意义（

＜0.05）。见图5。

研发阿尔茨海默病药物的研究人员正在选择β-淀粉样蛋白和tau蛋白之外的研究对象，这些蛋白曾经长期被认为是寻求治疗方案的关键。下面的条状图表明：2008年和2017年，国家老龄化研究所对各种不同研究主题资金投入的百分比。

2.6 复合藻对小鼠皮肤成纤维细胞中屏障功能相关蛋白表达的影响：成纤维细胞中COL1A2和COL3A1 mRNA水平降低，蛋白水平表达降低，模型组与正常对照组比较差异具有统计学意义（

＜0.05）；而给予复合藻干预后，成纤维细胞中COL1A2和COL3A1 mRNA水平较模型组显著升高，高剂量组与模型组比较差异具有统计学意义（

＜0.05）。同时复合藻可促进胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ型在成纤维细胞中的表达，促进细胞屏障功能的恢复，中、高剂量组与模型组比较差异具有统计学意义（

＜0.05）。见图6～7。

3 讨论

真皮细胞外基质中的胶原蛋白为完整皮肤纤维提供附着点和机械阻力，但当皮肤暴露在紫外线下辐照（光老化）或氧化应激（时间老化），活性氧激活信号级联导致胶原蛋白合成减少，基质金属蛋白酶含量增加。活性基质金属蛋白酶可切割胶原细胞外基质，此外被切割生成的胶原蛋白碎片会进一步刺激并通过上调基质金属蛋白酶表达和下调胶原生成，从而促进皮肤促老化的发生

。

海藻的主要生物活性成分包括：多酚、褐藻多糖、间苯三甲酸酯、类胡萝卜素等

。有研究从昆布、螺旋藻、石花菜3种海藻中提取海藻多糖，研究发现其具有显著的抗氧化、吸湿保湿和抗紫外线功效

。同时近期有研究将积雪草苷与海藻酸钠制备为皮肤修复贴剂，发现家兔皮肤中炎性细胞浸润较少、新生毛细血管较多

。也有采用海藻多糖敷料制备皮肤修复贴用于面部激光术后皮肤修复，结果表明其功效与透明质酸敷料制备的皮肤修复贴相近

。

本研究采用课题组前期开发的褐藻（海带、墨角藻、巨藻）及小球藻以适宜的比例组成的复合藻考察其在皮肤屏障功能改善中的作用。胶原蛋白是皮肤延缓衰老的关键物质，但该复合藻在胶原蛋白流失的作用有待明确。因此本研究通过采用D-半乳糖诱导小鼠皮肤衰老模型，考察复合藻对其改善作用。D-半乳糖诱导小鼠皮肤衰老是模拟皮肤自然衰老的经典模型，可引起皮肤组织中氧化应激反应的发生，导致皮肤胶原蛋白及相关蛋白酶的显著改变。本研究结果表明，D-半乳糖刺激后小鼠皮肤中皮肤水分丢失显著，透明质酸、羟脯氨酸、胶原蛋白和纤连蛋白含量明显降低，小鼠原代皮肤成纤维细胞活力降低，同时皮肤细胞中COL1A2和COL3A1 mRNA水平降低，胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ型表达显著降低。复合藻可以明显改善D-半乳糖刺激导致的小鼠背部皮肤水分丢失，明显改善模型小鼠中透明质酸、羟脯氨酸含量，升高胶原蛋白和纤连蛋白含量，减少氧化应激指标；复合藻还可显著改善D-半乳糖导致的小鼠原代皮肤成纤维细胞活力降低，同时促进皮肤细胞中COL1A2和COL3A1 mRNA水平的升高，并促进胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ型的表达。胶原蛋白在皮肤组织中的屏障功能中扮演重要作用，胶原蛋白的缺失或降解均可导致皮肤屏障功能的丧失，导致皮肤褶皱、失水等现象的发生，而复合藻具有显著的恢复胶原蛋白合成的作用，但其分子机制还有待进一步明确。

[1]Rittié L,Fisher G J.Natural and sun-induced aging of human skin[J].Cold Spring Harb Perspect Med,2015,5(1):a015370.

[2]Yamaguchi Y.Periostin in skin tissue and skin-related diseases[J].Allergol Int,2014,63(2):161-170.

[3]Shu Y,Ren H,Ao R,et al.Comparison of physical and chemical characteristics of collagen from the skin of cod (Gadus macrocephaius)[J].Genet Mol Res,2017,16(2).doi:10.4238/gmr16027940.

[4]Chattopadhyay S,Raines R T.Review collagen-based biomaterials for wound healing[J].Biopolymers,2014,101(8):821-833.

[5]Agarwal P,Zwolanek D,Keene D R,et al.Collagen XII and XIV, new partners of cartilage oligomeric matrix protein in the skin extracellular matrix suprastructur[J].J Biol Chem,2012,287(27):22549-22559.

[6]Karna E,Szoka L,Huynh T Y L,et al.Proline-dependent regulation of collagen metabolism[J].Cell Mol Life Sci,2020,77(10):1911-1918.

[7]Egbert M,Ruetze M,Sattler M,et al.The matricellular protein periostin contributes to proper collagen function and is downregulated during skin aging[J].J Dermatol Sci,2014,73(1):40-48.

[8]Fisher G J,Kang S,Varani J,et al.Mechanisms of photoaging and chronological skin aging[J].Arch Dermatol,2002,138(11):1462-1470.

[9]Jesumani V,Du H,Aslam M.et al.Potential use of seaweed bioactive compounds in skincare—a review[J].Mar Drugs,2019,17(12):688.

[10]Evi S,Ratih P,Hendra M,et al.Cosmeceuticals properties of sea cucumbers: prospects and trends[J].Cosmetics,2017,4:26.

[11]张松,党学良,石磊,等.复合藻通过调节Stir3改善线粒体能量平衡抑制紫外线诱导的皮肤光老化[J].中国医疗美容,2020,10(7):65-70.

[12]Holt D R,Kirk S J,Regan M C,et al.Eff ect of age on wound healing in healthy human beings[J].Surgery,1992,112(2):293-297,discussion297-298.

[13]Mine S,Fortunel N O,Pageon H,et al.Aging alters functionally human dermal papillary fibroblasts butnot reticular fibroblasts:A new view of skin morphogenesis and aging[J].PLoS One,2008,3(12):e4066.

[14]Luebberding S,Krueger N,Kerscher M.Age-related changes in skin barrier function—quantitative evaluationof150 female subjects[J].Int J Cosmet Sci,2013,35(2):183-190.

[15]Fernando I P S,Kim K N,Kim D,et al.Algal polysaccharides:potential bioactive substances for cosmeceutical applications[J].Crit Rev Biotechnol,2018,9:1-15.

[16]景永帅,金姗,张丹参,等.3种海藻多糖的理化性质和护肤功效研究[J].日用化学工业,2021,51(2):121-126,138.

[17]郭家棋,郭敏慧,孔松芝,等.积雪草苷-海藻酸钠修复贴的制备及其创伤修复作用研究[J].中草药,2020,51(19):4934-4942.

[18]丁利营,李红艳,赵绛波,等.皮肤屏障修复贴海藻糖敷料对面部激光术后皮肤修复的临床观察[J].中国医疗美容,2017,7(1):35-39.