需氧菌总数能力验证的结果与分析

汤曼莉 吴愫青 杨玉玲 李辉

（珠海市食品药品检验所 广东 珠海 519090）

1 前言

能力验证是利用实验室间的比对，按预先制订的准则评价参与者能力的活动[1-2]，有助于实验室进行质量控制、完善管理制度，评价检测水平[3]。2021年，本实验室参与了由中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织并提供样品的《需氧菌总数能力验证测量审核》能力验证活动，本文分析和总结能力验证结果，以期为相关人员提供参考。

2 材料与方法

2.1 培养基及试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号：1103601，广东环凯微生物科技有限公司）；pH氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：1090981，广东环凯微生物科技有限公司）；红四氮唑（TTC，批号：C10105859，上海麦克林生化科技有限公司）。灭菌水由本实验室纯化水系统自制。

2.2 仪器与设备

脉动真空灭菌器（BiST-A-D360D-A型，山东新华医疗器械股份有限公司）；培养箱（BRE 240型，Froilabo）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9123A型，上海申贤恒温设备厂）；生物安全柜（1379型，Thermo）。

2.3 测试样品

非无菌药品中需氧菌总数检测样品（编号：MA21-R347，中国检验检疫科学研究院测试评价中心）。

2.4 检验方法

按照组织方下发的《测量审核作业指导书》和《中国药典》2020年版四部“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”的要求进行检验。样品开启后加入20 ml无菌水进行复溶，待充分溶解后作为供试品原液（100）进行检验，设置4个梯度稀释级别（100、10-1、10-2、10-3），每个级别设置2个平行平皿。安排3位检验人员按照上述方法，进行平行操作检验，各自独立完成操作、计数、计算和检验报告撰写等工作。

2.5 平板计数与z值计算

2.5.1 平板计数

3位检验人员分别在24 h、48 h、72 h对平板进行观察、计数，并记录结果，换算成样品中的需氧菌总数。

2.5.2 z值的计算

样品的测试结果采用“z-比分数”评价，z比分数计算公式如式（1）所示。

式中：x——测试人提供的测试结果；X——指定值/对数值（中位值）；σ——标准差（样品的标准化四分位间距）。当|z|≤2时，结果判定为“满意”；当2＜|z|＜3时，结果判定为“可疑”；当|z|≥3时，结果判定为“不满意”。

3 结果与分析

3.1 平板计数结果

选取菌落数在50～300 cfu的平板，作为最终计数结果，样品MA21-R347及空白对照在TSA平板上的计数结果见表1、表2和表3。

表2 检验人员2的平板计数结果

表3 检验人员3的平板计数结果

通过计数发现样品原液，即100级别菌落数量过多，无法计数；10-2、10-3级别菌落数过少，2个平行平皿间出现较大的计数差异，易导致计数结果不准确；10-1级别菌落在300～400 cfu之间，更适合作为计数平皿。因此，选择10-1级别平皿计数的菌落报告结果。

通过观察发现：48 h时，平板上的菌落生长过于旺盛，菌落变大、融合成片，严重影响计数；72 h时，100、10-1、10-2这3个级别的平皿上，菌落几乎完全融合成片，无法计数。因此，3位检验人员的计数结果均采用培养24 h的结果，详见表1。

表1 检验人员1的平板计数结果

为观察培养基中加入TTC（浓度0.001%）与不加入TTC对检验人员观察结果的影响，检验人员1同时制备1份平行样品，采用不加入TTC的培养基进行培养，计数结果见表4。可见培养基中未加TTC的平皿上，生长的菌落稍大一些，出现了不易辨别的碎屑状物质，增加了菌落计数的难度。

表4 检验人员1采用不加入TTC的培养基的检验结果

3.2 实验结果的确定与评价

本次能力验证实验的最终结果，以检验人员1的结果上报：3 400 CFU/mL。根据组织方提供的结果报告，本实验室收到的样品，编号：MA21-R347，其指定值（对数形式）：3.543 log10 CFU/mL；能力评定标准差σ：0.125 log10 CFU/mL。因此，本实验室的结果为“满意”（3 400 CFU/mL，对数形式：3.531 log10 CFU/mL，z值：-0.1）。

根据组织方报告中的指定值，人员和方法比对试验结果的z值见表5。

表5 试验结果与z值统计表

4 讨论

本实验室参加了中国检验检疫科学研究院测试评价中心的非无菌药品中需氧菌总数能力验证，根据《测量审核作业指导书》和《中国药典》2020年版四部“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”的要求进行检验，最终得到满意结果，说明本实验室具备检验非无菌药品中需氧菌总数检验能力。

在检验中，本实验室采用了多个稀释级别、平行样、人员比对、方法比对等方式，从不同方面验证了本实验室需氧菌总数检验计数的准确性，并考察了本实验室检验人员之间的技术能力差异。结果表明，本实验室的3位检验人员均能独立完成实验并出具检验报告，其检验结果|z|值均为“满意”，人员之间的误差也较小。

另外，本实验室还采取了同一检验人员对同一检品分别使用含有0.5% TTC的培养基和不含有TTC的培养基进行培养，来进行检验方法比对，2种方法的|z|值均＜2，结果为“满意”。而使用不含有TTC的培养基时，计数结果略大于使用含有0.001%TTC的培养基进行培养的结果。有文献报道红四氮唑（TTC）具有抑制某些革兰氏阳性菌生长的作用，可防止菌落蔓延，有助于菌落总数的计数观察[4-5]。因此出现这一结果，可能是由于在不使用TTC对菌落进行染色时，菌落本身的颜色与培养基的颜色相近，对部分微小的碎屑状物质无法进行准确判断，从而产生计数误差。

据蔡爱君[6]报道，在微生物检验中使用TTC法检出总菌落数显著优于其他方法，而我们在实际检验过程中也发现每1 000 mL培养基加入1 mL浓度为1% TTC后，计数更便利，准确性也有所提高。

本实验室在此之前参与的由中国食品药品检定研究院组织的“药品中需氧菌总数计数能力验证计划NIFDC-PT-340”，取得了不满意的结果，本文通过分析总结出一些经验：必须严格遵循检验程序，检验前仔细阅读《作业指导书》；检验过程中报告审核者和实际检验人员应加强交流，及时发现问题；应对样品进行合理稀释；注重人员比对，提高准确率；选用合适的计数方法，并进行计数复核。