内蒙古呼和浩特市杨树腐烂病病原菌鉴定

贾 伟，马 强，宿静瑶，李正男，刘义龙，孙平平*

(1.内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.呼和浩特市园林植保站，内蒙古 呼和浩特 010018)

杨树(Populusspp.)为杨柳科杨属植物，因速生性强、适应性广等特点，成为我国东北、西北和华北地区防护林、用材林和绿化的先锋树种[1]。杨树腐烂病又称烂皮病，是杨树干部的常见病及多发病，造成杨树树干干腐或枯梢[2]。干腐型在发病初期病斑呈水渍状暗褐色，温湿度适宜时，发病部位迅速坏死，皮层内部变软、腐烂，有酒糟味，后期病斑失水干缩下陷，病斑部树皮龟裂，与健康部形成明显无固定形状的黑褐色边缘，患病部位易与木质部剥离，病斑上长出许多黑色的针头状小突起，为病原菌的分生孢子器，湿度大时能从里面分泌出乳白色黏稠液体，遇空气变干后呈橙黄色或橙红色卷丝状，为病原菌的分生孢子角。枯梢型在发病初期呈暗灰色或暗褐色，不形成明显的病斑，病斑在适宜条件下不断扩大，包围树干近1周时，上部枯死[3]。发病严重时杨树整株死亡，甚至毁林，造成严重经济损失。杨树腐烂病除危害杨树外，还可危害杨柳科、榆科等林木树种，在我国南北方均严重发生[4-5]，在东北尤为严重，在川西高原和长江中游一带的发病率也高达50%，造成严重经济损失[6]。

随着杨树腐烂病的严重发生，目前已有多人对其病原菌进行分离和鉴定。郭开发等[7]利用ITS与β-tublin基因对新疆塔里木河下游胡杨树腐烂病的主要病原菌进行鉴定，确定新疆胡杨树腐烂病的病原为金黄壳囊孢(Cytosporachrysosperma)；孙祥瑞[8]利用形态学、组织学结合分子鉴定证明引起河北省白杨树腐烂病的病原菌为金黄壳囊孢(C.chrysosperma)，有性型为(Valsasordida)。Wang等[9]和Zhang等[10]研究表明C.chrysosperma、C.translucens、C.fugax(有性态为V.salicina)、C.atrocirrhata、C.kantschavelii、C.nivea(有性态为V.nivea)、C.tritici和C.davidiana8种腐烂病病原菌在国内杨树上均有发生。内蒙古地处我国北方，寒冷、干旱的气候条件给腐烂病菌的侵染提供了有利条件，腐烂病在内蒙古全境均严重发生。

为了明确内蒙古自治区呼和浩特市杨树腐烂病的病原菌种类，本研究于2020年4月对呼和浩特市内公园进行杨树腐烂病样品采集。对采集的表现为典型杨树腐烂病的样品进行了病原菌分离、致病性测定及病原菌鉴定。该结果将为内蒙古呼和浩特地区杨树腐烂病的防控提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料采集 于2020年4月在呼和浩特市的赛罕区草原丝绸之路文化公园、赛罕区敕勒川公园、新城区成吉思汗公园、玉泉区南湖公园和回民区新华公园5个公园进行杨树腐烂病样品的采集。新疆杨(Populusalbavar.pyramidalis)已经发展成为这些公园的主要栽培树种，本次采集的样品均为发病新疆杨。将采集的树皮组织置于自封保鲜袋中带回实验室4 ℃保存，用于病原菌的分离。

1.1.2 主要培养基和试剂 孟加拉红培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁(无水)0.5 g,孟加拉红0.033 g，氯霉素0.1 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

马铃薯葡萄糖培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL。

马铃薯葡萄糖液体培养基(Potato Dextrose，PD)：同PDA，不加琼脂粉。

普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR扩增试剂盒，购自北京聚合美生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 电热恒温培养箱，HPX-9162MBE，上海博讯实业有限公司；实体解剖镜，LEICA EZ4W，德国徕卡仪器有限公司；超净工作台(SW-CJ-1FD)，上海博讯实业有限公司；显微镜，LEICA ICC50W，德国徕卡仪器有限公司；电泳仪，BG-Power 600K450W，北京百晶生物技术有限公司；PCR仪，624BR47696，美国伯乐 Bio-Rad 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化 采用常规组织分离法[11]分离病原菌：取采集到的杨树皮，选取病健交界处组织，依次用1%次氯酸钠浸泡3 min，75%酒精浸泡30 s，灭菌水漂洗3次，放入孟加拉红培养基上，28 ℃恒温培养3～4 d；挑取菌落形态不同的菌丝转入PDA平板上恒温培养，28 ℃继续恒温培养3～4 d后挑取菌落边缘菌丝移入新的PDA平板，继续恒温培养，重复以上操作直至得到纯培养物。所得菌种均保存在内蒙古农业大学园艺与植物保护学院果树病害病原生物学及综合防控研究室。

1.2.2 病原菌的致病性检测 参照乔国彪等[12]的方法进行病原菌的致病性检测。在内蒙古农业大学新区校园中取2年生的健康杨树枝条，去除叶片后将其截成10～15 cm长。依次用1%的次氯酸钠浸泡5 min，75%酒精浸泡3 min，无菌水冲洗3次，风干后用石蜡封住枝条两端。用6 mm直径的实心打孔器烫伤树皮后，去掉烫伤树皮，在烫伤位点接种在PDA上培养了5 d、直径为6 mm待测分离物菌饼，浸湿无菌脱脂棉裹住接种位点后用保鲜膜包扎，每个处理重复10个枝条。以只接种PDA培养基的枝条作为阴性对照。处理枝条置于铺有双层纱布的塑料盘中，保鲜膜封口保湿，25 ℃、16 h光照/8 h黑暗、70%湿度条件下培养，在处理后5 d去掉脱脂棉，用保鲜膜包扎后继续培养，定时观察记录发病情况。致病性检测试验重复3次。

1.2.3 病原菌鉴定

1.2.3.1 病原菌形态观察 将病原菌接种于PDA平板上，28 ℃恒温培养，定期观察菌落特征，并在显微镜下观察发病枝条上子实体的横切面形态结构及孢子形态特征。

1.2.3.2 病原菌的分子鉴定 用无菌接种环挑取病原菌菌丝至PD液体培养基中，180 r/min、28 ℃恒温培养5 d，用双层无菌纱布过滤收集菌丝体，28 ℃烘箱中烘干，液氮研磨。利用真菌DNA提取试剂盒提取病原菌的DNA。

以DNA为模板，分别采用通用引物ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b扩增病原菌的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)和β微管蛋白(β-tubulin，TUB2)。ITS序列的PCR反应体系均为：2×M5 Hipper超光速Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL；反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min。TUB2序列PCR反应的退火温度为61 ℃，其余同ITS序列。PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖电泳检测，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen，北京)回收纯化后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序结果在NCBI利用BLASTn上进行同源序列检索，选取相似序列，应用MEGA 6.0软件，采用ClustalW算法对序列进行比对，用比邻法(neighbor-joining，NJ)，校正值设定为1 000，构建系统发育进化树[13]。

2 结果与分析

2.1 病害症状和病害调查

在采样的5个地点发病杨树主要表现为干腐型危害症状，主干树皮坏死、下陷，树皮上有黑色分生孢子器或黄色孢子角，坏死组织与健康组织形成明显的病健交接，树皮容易从树体剥落；对于新发病杨树主要表现为发病部位组织液外渗，有明显的酒糟味(图1)。在调查的176株新疆杨中，发病杨树共30株，发病率占到5.9%。

注：a.感病杨树表现为发病部位组织液外流；b.感病杨树表现为主干树皮坏死。图1 感染腐烂病杨树症状Fig.1 Poplar with stem rot symptoms

2.2 菌株分离、致病性检测及组织形态观察

从采集的样品上共分离、纯化得到8个菌株分别为从赛罕区草原丝绸之路文化公园分离的YSFL1、赛罕区敕勒川公园分离的YSFL2、新城区成吉思汗公园分离的YSFL3，玉泉区南湖公园分离的YSFL4-1、YSFL4-2、回民区新华公园分离的YSFL5-1、YSFL5-2和YSFL5-3。对分离得到的8个菌株进行致病性检测，结果显示，接种了病原菌YSFL1、YSFL3和YSFL4-2的杨树枝条均在接种后14 d开始发病，而其他杨树枝条均未发病。首先是接种部位出现腐烂变软的现象，YSFL3与YSFL4-2接种后20 d病斑表面树皮皱缩，病健交界明显；25 d后在接种部位周边出现黑色或黄褐色的分生孢子器，随后扩散到整枝，子实体的孔口溢出黄色胶质卷丝状物，为分生孢子角。YSFL1在接种后2～3个月在接种部位产生黑色产孢体，随后溢出橙黄色分生孢子角(图 2)。显微镜观察3个菌株的分生孢子器，产孢体均为多腔室，分生孢子无色、单孢、腊肠型，YSFL1的孢子长约为3.20 μm，YSFL3与YSFL4的孢子长约为4.53 μm与4.52 μm(图3)，3株菌的发病特性、分生孢子器及分生孢子形态完全符合杨树腐烂病菌致病特性[3,14]。

注：CK为接种PDA，YSFL1为接种后3个月，YSFL3和YSFL4-2为接种后1个月。图2 YSFL1、YSFL3和YSFL4-2致病菌在杨树枝条上的危害症状Fig.2 Symptoms of poplar branches inoculated with YSFL1,YSFL3 and YSFL4-2

注：a1、b1、c1为YSFL1、YSFL3、YSFL4-2的分生孢子器切面；a2、b2、c2为YSFL1、YSFL3、YSFL4-2的分生孢子。图3 YSFL1、YSFL3和YSFL4-2的产孢体横切面和分生孢子Fig.3 Transverse microtome section of the conidiomata,and the conidia of YSFL1、YSFL3 and YSFL4-2

2.3 病原菌皿内培养特征观察

病原菌YSFL1在PDA培养基培养7 d后菌落由中心向四周呈放射状分布，病原菌正面灰白色，菌丝紧密；背面黑黄相间。20 d后菌落颜色加深，正面中心为灰白色，菌落前沿为深灰色，背面中心为深黄色与黑色相间，前沿为黑色(图4)。根据菌落特征及产孢体和分生孢子的组织形态观察，初步判断菌株YSFL1符合隐球壳属(Cryptosphaerialsp.)基本特征[15]。

注：a1、b1、c1为YSFL1培养7 d，YSFL3、YSFL4-2培养5 d的皿内形态；a2、b2、c2为YSFL1培养20 d， YSFL3、YSFL4-2培养14 d的皿内形态。图4 YSFL1、YSFL3与YSFL4-2的皿内形态Fig.4 The morphologic characters of YSFL1,YSFL3 and YSFL4-2 on PDA medium

病原菌YSFL3在PDA培养基培养5 d后菌落正面呈黄灰色，背面为白色和淡黄色，14 d后菌落正面为浅棕色，背面为黄色，YSFL4-2在PDA培养基上培养5 d后菌落呈白色，14 d为浅棕色。14 d后菌落YSFL3与YSFL4-2均长出黑色球状产孢体为分生孢子器，上有黄色孢子角产生(图4)。根据菌落特征及产孢体形态，初步判断菌株 YSFL3、4-2符合壳囊孢属(Cytosporasp.)基本特征[14]。

2.4 病原菌分子鉴定

采用通用引物ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b从菌株YSFL1、3、4-2分别克隆获得了长度为576、595和591 bp的ITS基因片段和417、498、496 bp的BTU2片段，将上述基因序列在NCBI数据库中通过BLASTn程序进行同源序列比对，选择近缘序列使用MEGA 6.0构建系统发育进化树(图5、图6)，结果表明：YSFL1的ITS序列与BUT2序列均与Cryptosphaerialpullmanensis聚在一枝上，因此YSFL1被鉴定为C.pullmanensis。菌株YSFL3与YSFL4-2的ITS、BUT2序列均与Cytosporatritici、Cytosporachrysosperma、Valsasordida聚在一枝上。V.sordida为C.chrysosperma的有性型[5]，因此YSFL3、YSFL4-2为C.tritici、C.chrysosperma中的一种。结合培养特性与组织观察，由于C.tritici在PDA上的菌丝密度比C.chrysosperma小，在PDA中不能产生产孢体[5,10]，分生孢子平均长度达到5.04 μm，略长于C.chrysosperma的4.52 μm[14]，而本研究分离的YSFL3和YSFL4-2在PDA上的菌丝生长紧密，均能产生分生孢子器，分生孢子为4.52 μm，形态学、组织学结合分子序列确定YSFL3与YSFL4-2属于C.chrysosperma。

图5 基于ITS序列的系统发育进化树Fig.5 The phylogenetic tree constructed based on the ITS sequences

图6 基于β-tubulin序列的系统发育进化树Fig.6 The phylogenetic tree constructed based on the β-tubulin sequences

3 结论与讨论

本研究从内蒙古呼和浩特市的赛罕区、新城区、玉泉区与回民区公园的新疆杨上采集样品，并从赛罕区草原丝绸之路文化公园、新城区成吉思汗公园与玉泉区南湖公园的杨树样品中分别分离得到YSFL1、YSFL3、YSFL4-2 3株能引起杨树腐烂病的病原真菌，形态学、组织学结合ITS与BTU2序列分析将其鉴定为隐球壳属的C.pullmanensis(YSFL1)与壳囊孢属的金黄壳囊孢C.chrysosperma(YSFL3、YSFL4-2)。

本研究利用ITS与TUB2序列构建进化树，YSFL1均与C.pullmanensis聚到一枝，YSFL1在PDA培养基上培养20 d仍未有产孢体产生，接种枝条后2～3个月才有产孢体及橙黄色孢子角产生，该结果与隐球壳属腐烂病发病时间较长，不易产生产孢体，会造成树皮死亡、变黑、呈煤烟色相一致[16]。Adam等[17]在分析南非Cytospora真菌系统发育关系时也发现利用ITS序列建立的系统发育树无法将C.tritici与C.chrysosperma区分开，该研究认为2个种为一个“种复合体”。张玉博等[14]对中国壳囊孢属真菌系统发育关系进行分析时也发现利用ITS序列无法将2个种分开，而利用TUB2与TEF序列构建系统发育进化树C.tritici均能单独聚为一枝，但是在NCBI中查不到该研究中所用C.tritici菌株的TUB2与TEF序列。本研究利用YSFL3与YSFL4的ITS与TUB2序列构建的系统发育进化树均不能区分C.tritici与C.chrysosperma，结合培养特性与组织学观察，YSFL3、YSFL4-2的分生孢子为4.52 μm，在PDA上的菌丝生长紧密，均能产生分生孢子器，结合形态学与分子序列确定YSFL3与YSFL4-2属于C.chrysosperma。该结果与张玉博等[14]提出利用培养特征、组织学观察和分子序列等多个手段相结合是对杨树腐烂病进行鉴定的有效手段一致。

金黄壳囊孢(C.chrysosperma)，有性型为V.sordida，是造成杨树腐烂病的主要病原菌。此外，C.translucens、C.fugax、C.atrocirrhata、C.kantschavelii、C.nivea、C.tritici和C.davidiana等也是我国杨树腐烂病的病原菌[9-10]。目前在内蒙古地区加格达奇、乌兰浩特和土默特的杨树(Populussp.)、满归的大青杨(Populusussuriensis)、呼和浩特的山杨树(Populusdavidiana)上均分离到了C.chrysosperma[14]，除此之外，在内蒙古杨树、山杨树、大青杨上也分离到C.davidiana、C.fugax、C.atrocirrhata、与C.translucens腐烂病病原菌[9,14]。本研究在内蒙古呼和浩特市赛罕区草原丝绸之路文化公园、新城区成吉思汗公园，玉泉区南湖公园的新疆杨上发现了C.pullmanensis与C.chrysosperma引起杨树腐烂病的发生，该结果是对内蒙古地区杨树腐烂病病原菌种类的有力补充。

在美国，C.pullmanensis是引起弗里氏杨树(P.fremontii)的主要病原菌，在美国西部几乎所有的杨树上均有发生[18]。Mehrabi等[19]于2017年首次在伊朗发现C.pullmanensis可引起黑杨(Populusnigra)的腐烂病。Ma等[15]于2016年报道了C.pullmanensis可引起我国新疆地区的银白杨树(Populusalba)的腐烂病。郭开发等[20]于2018年对新疆农田防护林杨树腐烂病的病原进行鉴定，发现箭杆杨(P.nigracv.afghanica)和胡杨(Populuseuphratica)的腐烂病均由C.pullmanensis引起，新疆杨(P.albacv.pyramidalis)上的病原菌为C.chrysosperma、C.nivea，未发现C.pullmanensis。本研究首次在内蒙古发现C.pullmanensis可引起新疆杨树腐烂病，该结果是对C.pullmanensis的寄主及发生地点的有力补充，为开展杨树的防治和病原菌的鉴别研究奠定基础。