光照和渗透胁迫对枸杞离体叶片花青苷积累的影响

郭铁城，曾海涛，徐 皓，唐 琪，赵冠杰，崔卓越，苟玉琴

(陕西理工大学 生物科学与工程学院/秦巴山区生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室(培育)/陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西 汉中 723000)

近年来，随着食品工业的发展，色素类物质的运用在食品的生产过程中越来越广泛，但是许多合成类色素在安全性上还存在着诸多隐患，部分合成类色素具有毒害作用，更有甚者还具有致癌作用。因此，越来越多的合成类色素在食品工业上被禁止使用[1]，而天然色素逐渐受到人们的青睐。

花青苷作为一种天然无毒色素，因其具有溶于水、无毒、广泛的颜色以及可抗炎、抗菌、抗肿瘤、增强心脏健康、预防高血压、预防神经退行性疾病、增强运动表现和恢复能力等保健功效[2-6]，具有广阔的市场前景和巨大的开发价值，开始受到越来越多科研人员的关注。但是花青苷又存在一定的缺点，即稳定性较差，现在有一些方法可以解决这个问题：壳聚糖封装以增加稳定性、将其包裹在脂质体中或用超临界CO2作为溶剂[7-8]。目前，对于花青苷的应用已经十分广泛，胡萝卜中的花青苷已经作为一种优良稳定的着色剂，用于食品、饮料和工业着色，甜菜中的花青苷也作为一种安全、天然、食用色素来代替旧的合成色素[9-10]。

花青苷是植物中广泛存在的一类水溶性的天然色素和次生物质，其主要存在于植物的花、果实、叶片、茎、根当中，花青苷的含量、种类和分布是植物这些器官的色彩形成的重要原因，花青苷对植物的生长、发育、繁殖、种子传播起到至关重要的作用，可以帮助植物进行授粉[11]、传播种子、保护植物免收紫外辐射的伤害和抗氧化[12]、活性氧(ROS)诱导的信号级联介质[13]、金属和准金属螯合剂[14]、叶片衰老的延迟层(特别是在营养缺乏的植物中)[15]。

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)，茄科枸杞属，多年生双子叶多棘刺灌木，分布于我国青海东部、新疆北部、内蒙古西部、陕西北部、甘肃和西藏等地。黑果枸杞果实味甜多汁、营养丰富，被誉为荒漠中的“软黄金”和“黑珍珠”，花青苷含量丰富、极具研究和开发价值[1,16]。已有研究证明，花青苷的合成植物生长的环境条件比如光照强度、光周期、光质、培养基的蔗糖浓度、pH、激素的浓度及温度有关。本研究以黑果枸杞和‘宁杞7号’红枸杞为材料，研究了光照和渗透胁迫处理对枸杞离体叶片花青苷积累的影响。结果发现，不同蔗糖浓度和单色光处理可显著影响枸杞离体叶片中花青苷积累，且不同枸杞材料诱导花青苷积累的最适蔗糖浓度及最适单色光差异显著。本研究结果为后续以枸杞叶片愈伤组织或悬浮细胞作为生物反应器大量生产花青苷提供了重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞无菌苗叶片，(‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞种子取自宁夏农林科学院)

1.2 方法

1.2.1 枸杞种子消毒 分别取适量的‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞种子于50 mL离心管中，于超净台中加入无菌水15 mL，反复震荡摇晃3 min，倒掉无菌水；加入75%乙醇15 mL震荡30 s，倒掉酒精；用无菌水洗2遍后加入20 mL 10%的NaClO，震荡10～15 min；最后再用无菌水洗3次。

1.2.2 枸杞幼苗的获取 配置1 L MS培养基(MS粉末4.74 g、蔗糖20 g、琼脂粉7 g)于20个培养瓶中，每个培养瓶50 mL培养基，并用封口膜封住，高压蒸汽灭菌121 ℃、15 min；在超净台中将适量消毒后的枸杞种子均匀分布于MS固体培养基上；光照/黑暗为16 h/8 h、15 000 lx、温度 25 ℃，培养25 d。

1.2.3 枸杞叶片离体培养 配制含不同浓度蔗糖溶液：0、50、100、150、200、300、400、500、600 mmol/L的MS培养基(含MS粉末 4.74 g、NaCl 10 g、琼脂7 g，去离子水1 000 mL)各500 mL，加入NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，高压蒸汽灭菌121 ℃、15 min。待其温度冷却到60 ℃左右时，倒入直径9 cm玻璃培养皿中，每个培养皿倒入20 mL。在培养皿中无菌水浸湿的3层滤纸上，将萌发25 d的枸杞无菌苗叶片切割成1 cm长度的叶段，放至上述固体培养基上。单波长光照(蓝光:450 nm、5 000 lx；红光:650 nm、5 000 lx；远红光:730 nm、50 W)，16 h光照/8 h黑暗、25 ℃培养7 d。

1.2.4 花青苷含量的测定 将诱导处理后的枸杞叶片取出，在液氮充分研磨成粉末，装入2 mL离心管中，并称量质量；在每个离心管中加入300 μL 1%盐酸(甲醇稀释)，3 000 r/min离心3 min将粉末甩到管底溶液中，然后放入摇床中100 r/min、4 ℃黑暗条件下震荡过夜；将离心管于4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取0.25 mL上清至新管中，加入250 μL无菌水，混匀；加入500 μL氯仿，混匀，然后于4 ℃、12 000 r/min离心5 min；吸取350 μL上清至新管中，加入650 μL的1%盐酸(甲醇稀释)，用分光光度计测定A530和A657(A530和A657均代表吸光度)，测量3次，取平均值，计算每克鲜重叶片中花青苷含量。

每克鲜质量叶片中花青苷含量(units·g-1)=(A530-0.25×A657)/叶片重量

1.2.5 数据统计与分析 测量得到的结果通过公式计算得到不同蔗糖浓度和光照处理下‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞离体叶片花青苷的含量，采用独立样方T检验方法分析比较蔗糖浓度和光照对‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞离体叶片花青苷的含量的影响。

2 结果与分析

2.1 枸杞无菌苗培养

将消毒后的2种枸杞种子，点种到MS固体培养基上，萌发25 d后的幼苗形态差异显著：黑果枸杞叶片条状披针形、微弯曲，而‘宁杞7号’红枸杞叶片较宽、长椭圆状披针形、顶端渐尖(图1)。

图1 枸杞无菌苗Fig.1 Sterile seedlings of wolfberry

2.2 不同光照和渗透胁迫对枸杞离体叶片中花青苷积累的影响

2.2.1 白光下不同蔗糖浓度对枸杞离体叶片中花青苷积累的影响 白光(15 000 lx)处理下，‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞叶片中花青苷积累均随着蔗糖浓度的升高而逐渐增加，但在600 mmol/L时下降(图2)。其中，蔗糖浓度为0 mmol/L时，红枸杞叶片中花青苷的积累显著低于黑果枸杞，且差异极显著(P<0.01)，但花青苷含量均相对较低；蔗糖浓度500 mmol/L时，诱导花青苷积累达到最高，‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞叶片花青苷含量分别为2.33 units/g和3.10 units/g，二者差异显著(P<0.05)；蔗糖浓度600 mmol/L时，2种叶片均失水严重、且逐渐萎蔫，‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞叶片花青苷含量分别下降到0.96 units/g和0.85 units/g。

图2 白光下不同蔗糖浓度诱导的花青苷积累Fig.2 Anthocyanin accumulation induced by different sucrose concentrations under white light

上述结果表明，‘宁杞7号’红枸杞叶片中本底花青苷含量显著低于黑果枸杞叶片；随着蔗糖浓度的升高，逐渐提高的渗透胁迫可显著促进枸杞离体叶片中的花青苷积累；过高浓度的蔗糖会导致叶片严重失水，逐渐萎蔫甚至死亡，此时花青苷含量下降。

2.2.2 蓝光下不同蔗糖浓度对枸杞离体叶片中花青苷积累的影响 蓝光(450 nm)处理下，‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞叶片中花青苷积累均随着蔗糖浓度升高而逐渐增加，但在600 mmol/L时下降(图3)。其中，蔗糖浓度为0 mmol/L时，红枸杞叶片中花青苷的积累显著低于黑果枸杞，且差异极显著(P<0.01)，但花青苷含量均相对较低；蔗糖浓度500 mmol/L时，黑果枸杞叶片花青苷积累量达到最高：9.49 units/g；‘宁杞7号’红枸杞叶片中，当蔗糖浓度400 mm时花青苷诱导量达到最高3.28 units/g，但仅为黑果枸杞叶片中花青苷积累最高值的34.9%，差异极显著(P<0.01)。

图3 蓝光下不同蔗糖浓度诱导的花青苷积累Fig.3 Anthocyanin accumulation induced by different sucrose concentrations under blue light

2.2.3 红光下不同蔗糖浓度对枸杞离体叶片中花青苷积累的影响 红光(650 nm)处理下，‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞叶片中花青苷积累均随着蔗糖浓度的升高而逐渐增加，但在600 mmol/L时下降(图4)。其中，蔗糖浓度为0 mmol/L时，红枸杞叶片中花青苷的积累显著低于黑果枸杞，且差异极显著(P<0.01)，但花青苷含量均相对较低；‘宁杞7号’红枸杞叶片中，蔗糖浓度500 mmol/L时叶片花青苷诱导积累最高，达到9.77 units/g；黑果枸杞叶片中，当蔗糖浓度400 mm时花青苷诱导量达到最高3.56 units/g，为 ‘宁杞7号’红枸杞叶片中花青苷积累最高值的36.4%，差异极显著(P<0.01)。

图4 红光下不同蔗糖浓度诱导的花青苷积累Fig.4 Anthocyanin accumulation induced by different sucrose concentrations under red light

2.2.4 远红光下不同蔗糖浓度对枸杞离体叶片中花青苷积累的影响 730 nm远红光处理下，‘宁杞7号’红枸杞和黑果枸杞叶片中花青苷积累均随着蔗糖浓度的升高而逐渐增加，但在600 mmol/L时下降(图5)。其中，蔗糖浓度为0 mmol/L时，红枸杞叶片中花青苷的积累显著低于黑果枸杞，且差异极显著(P<0.01)，但花青苷含量均相对较低；‘宁杞7号’红枸杞叶片中，蔗糖浓度400 mmol/L时叶片花青苷诱导积累达到最高2.36 units/g；黑果枸杞叶片中，当蔗糖浓度500 mmol/L时花青苷诱导量达到最高0.79 units/g，为 ‘宁杞7号’红枸杞叶片花青苷积累量的33.5%，差异极显著(P<0.01)。

图5 远红光下不同蔗糖浓度诱导的花青苷积累Fig.5 Anthocyanin accumulation induced by different sucrose concentrations under far-red light

2.2.5 不同单色光对枸杞离体叶片中花青苷积累的影响 如上所述，当蔗糖浓度达到400～500 mmol/L时，黑果枸杞和‘宁杞7号’红枸杞叶片花青苷积累会达到最大值，此时的蔗糖浓度是诱导枸杞离体叶片花青苷积累的最适蔗糖浓度。但是，不同的光照条件对花青苷积累的影响差异显著(图6)，其中，较长波长的红光和远红光处理下，当蔗糖浓度500 mmol/L时，‘宁杞7号’红枸杞叶片中花青苷积累显著高于黑果枸杞叶片中的积累(P<0.01)；而较短波长的蓝光处理下则与之相反，当蔗糖浓度500 mmol/L时，黑果枸杞离体叶片中的花青苷含量显著高于‘宁杞7号’红枸杞叶片中的积累(P<0.01)。

图6 不同单色光下红枸杞和黑果枸杞叶片花青苷积累Fig.6 Anthocyanin accumulation of L.barbarum and L.ruthenicum under different monochromatic light

3 结论与讨论

3.1 结论

本研究发现，不同渗透胁迫条件及单色光处理可显著影响枸杞离体叶片中花青苷积累。结果显示：1)蔗糖浓度为0 mmol/L时，不同光照处理下，红枸杞叶片中花青苷的积累显著低于黑果枸杞，且差异极显著(P<0.01)，但花青苷含量均相对较低；2)随着蔗糖浓度提高，‘宁杞7号’红枸杞与黑果枸杞离体叶片中花青苷积累均显著提高，蔗糖浓度达400～500mmol/L时2种枸杞离体叶片中花青苷的积累均达到最大值；3)蔗糖浓度相同时，不同波长光照(白光、远红光、红光、蓝光)处理下，枸杞离体叶片中花青苷积累差异显著；4)450 nm蓝光下，黑果枸杞离体叶片中花青苷积累量显著高于‘宁杞7号’红枸杞离体叶片中花青苷积累；5)650 nm红光处理，与蓝光下趋势相反，‘宁杞7号’红枸杞离体叶片中花青苷积累量显著高于黑果枸杞离体叶片中花青苷积累；6)730 nm远红光处理，与红光下趋势一致，但‘宁杞7号’红枸杞与黑果枸杞离体叶片中花青苷积累均显著低于其他光质条件下的花青苷积累。

3.2 讨论

花青苷类化合物种类繁多，具有良好的抗氧化活性和保健功效，具有广阔的应用前景，因其容易分解，在市场上的价格较高，从而制约了花青苷作为药物和保健品的研究与应用。本研究结果将为确定诱导枸杞叶片中花青苷积累的最佳条件，通过愈伤组织或悬浮细胞作为生物反应器大规模低成本生产高品质花青苷奠定良好基础。

糖在植物新陈代谢和能量产生中起着非常重要的作用，此外糖也作为一种广泛的信号分子，来调节植物基因表达、影响植物生命周期中许多重要过程。已有研究发现，植物中花青苷积累受到糖的诱导，但不同糖类物质对不同物种花青苷积累的影响不同。蔗糖是可诱导植物体内花青苷积累的主要糖类物质，能快速强烈地诱导花青苷积累，且具有浓度依赖性[17]。模式植物拟南芥中的研究发现，蔗糖可以作为信号分子，通过调节DFR、F3’H、CHS、MYB75、PAP1等基因的表达诱导花青苷积累[18-19]。此外，高浓度蔗糖还可以作为一种渗透胁迫，诱导花青苷的合成[20]。本研究结果显示，蔗糖可以诱导枸杞离体叶片中花青苷积累且具有浓度依赖性，高浓度蔗糖可对枸杞离体叶片产生渗透胁迫，从而诱导花青苷积累。这与Pasqua等[21]在喜树悬浮细胞培养中发现高浓度蔗糖可通过形成渗透胁迫诱导花青苷积累的结论一致。

光照也是影响花青苷积累的重要因子，光质、光强和光周期均能在一定程度上影响花青苷的积累[22]。目前，已经发现与枸杞同属茄科植物的番茄中，光敏色素PHYA、PHYB及蓝光受体CRY1A都可调节花青苷积累[23-25]。Lopez等[26]研究发现不同波长光照下西洋梨中花青苷积累差异显著的趋势相一致。据研究，生长在不同光照环境中植物的花色、叶色和果色通常不同，如蓝色花大多分布于高山地区，而平原地带蓝紫色花却相对较少，可能与高山地区光照中短波长的紫外线比例较高有关[27]。本研究结果表明，不同波长单色光对枸杞离体叶片花青苷积累的影响存在显著差异，其中波长较短的蓝色光照下黑果枸杞离体叶片中花青苷积累较高，而波长较长的红色光处理下‘宁杞7号’红枸杞离体叶片中花青苷积累较高。可能是因为黑果枸杞分布于海拔相对较高地区，对短波长光照反应敏感，而红枸杞经过在海拔相对较低地区的长期驯化和人工选择，更适宜相对较长波长的光照，这与上述文献结论相一致。

枸杞基因组测序的完成[28]，将对枸杞重要性状的分子机理研究及通过现代分子生物学等手段培育枸杞新品种起到非常重要的推动作用。目前，本研究团队已经通过基因组中同源序列分析，比对到枸杞基因组中相应的光受体以及花青苷代谢途径关键基因序列，本研究的研究结果为下一步通过qPCR检测花青苷积累关键基因及相应光受体基因表达，研究不同光照和渗透胁迫条件下红枸杞和黑果枸杞中花青苷积累差异的分子机理奠定了重要基础。