异氟醚对不同年龄段小鼠海马线粒体和神经元树突形态的影响

石青青，喻理晟，王世全，薛姗姗，周翠红，谭庆荣，彭正午

(1空军军医大学西京医院心身科，陕西 西安 710032； 2西安医学院研究生院，陕西 西安 710021)

全世界每年约有超过2亿人接受手术[1-2]，其中近80%的病例使用挥发性麻醉剂。异氟醚因其毒性小、诱导和苏醒迅速、麻醉深度易于调节等特性，被广泛应用于临床麻醉[3-4]。近年来的研究发现异氟醚可引起大脑神经毒性并导致术后认知障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)，而且老年患者暴露于异氟醚产生POCD的概率更高[5-7]。已有研究表明，在术后3个月，60岁以下的年轻患者POCD的发生率为0～5%，60～69岁的老年患者POCD的发生率为9.9%～14.3%，70岁以上的高龄患者POCD的发生率是60～69岁年龄组的2倍[8]。异氟醚导致POCD产生的具体机制尚不确切，研究显示海马神经元损伤是POCD发病的重要原因之一，异氟醚暴露可引起大鼠海马中的神经元细胞数量减少，导致海马结构和功能发生变化[9-11]。然而，异氟醚对海马神经元超微结构的影响及其对不同年龄段小鼠作用的差异尚不清楚。因此，本研究观察了青年和老年两个不同年龄段的小鼠吸入15 mL/L 异氟醚2 h后的行为学变化，并比较了异氟醚作用下，上述不同年龄段小鼠海马CA1区神经元线粒体、突触和神经元树突形态的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 所有活体实验均按照国家《实验动物关爱和使用指南》进行，并经空军军医大学实验动物福利委员会批准[许可证号：SYXK(陕)2019-001]。6月和18月龄雄性C57BL/6青年和老年小鼠购自空军军医大学实验动物中心。小鼠饲以SPF级维持饲料，正常摄入食物和饮用水，保持12 h照明/12 h黑暗交替，饲养温度22～25 ℃，相对湿度55%～58%，饲养环境保持清洁、安静。实验分组：青年组、青年吸醚组、老年组、老年吸醚组，每组各10只。

1.1.2 主要试剂和仪器 异氟醚(MACKLIN，266-75-46-7)；电镜固定液(Servicebio，G1102)；无水乙醇(MACKLIN，64-17-5)；丙酮(MACKLIN，127-06-0)；812包埋剂(SPI，90529-77-4)；超薄切片机(Leica，Leica UC7)；钻石切片刀(Daitome，Ultra 45°)；透射电子显微镜(HITACHI，HT 7700)；共聚焦显微镜(OLYMPUS, FV 1000)。

1.2 方法

1.2.1 吸醚处理 6月龄和18月龄实验小鼠各随机分为两组：青年组、青年吸醚组和老年组、老年吸醚组。青年组和老年组吸入1 000 mL/L O22 h；青年吸醚组和老年吸醚组吸入15 mL/L 异氟醚气体2 h。小鼠吸入异氟醚过程是在连接有麻醉气体监测仪的麻醉箱中进行的，吸醚过程中监控O2、CO2和异氟醚气体的浓度变化，使氧流量的流速在2 L/min，进入麻醉箱的气体要进行湿化，吸醚过程中小鼠需用加热垫保持其体温维持在37 ℃。待麻醉过程结束，将实验小鼠放回原笼中并时刻观察小鼠的状态，48 h后进行新物体识别测试。

1.2.2 新物体识别实验 新物体识别实验是利用小鼠先天对新奇物体有探索倾向而建立的一项行为学测试，用来评估实验动物的学习记忆能力[12]。实验开始前准备两个相同的物体A和一个不同的物体B，将小鼠放入测试箱适应30 min后，将两个A物体放入测试箱左右两端，实验开始后放入小鼠的位置与两物体的距离务必要保持一致。开启录像设备，记录小鼠嗅探左右A物体的次数，5 min之后将左右任一A物体撤掉换成B物体，同样记录5 min内小鼠嗅探A、B两物体的次数。每只小鼠测试结束均需用乙醇擦拭，并待乙醇气味挥发完全再进行下只小鼠的测试，避免上只小鼠的气味对下只小鼠造成干扰影响实验的真实性。

1.2.3 透射电镜制片 实验动物进行深度麻醉后，取新鲜小鼠脑组织海马部位，于3 min之内切取体积不超过1 mm × 1 mm × 1 mm的组织块，并将其迅速浸泡到电镜固定液中，4 ℃保存。固定2～4 h后用pH 7.4的磷酸缓冲液(0.1 mol/L)洗3次，每次10～15 min。室温下用10 mL/L的锇酸进行后固定，2 h后用0.1 mol/L磷酸缓冲液换洗3次，每次10～15 min。之后进行梯度脱水(依次放入500、700、800、900、950、1 000、1 000 mL/L乙醇以及1 000、1 000 mL/L丙酮中)，每次15 min。梯度脱水结束后，将其置于丙酮与812包埋剂按1∶1配制的混合液中先室温渗透2 h，再用2∶1的比例进行渗透过夜处理。60 ℃加热聚合48 h，完成组织包埋，并用Leica超薄切片机将其切成60～80 nm的薄片，以待进行铀铅双染色。染色结束将薄片放置室温干燥过夜，透射电子显微镜下观察，并采集图像分析(hitachi TEM system control)。线粒体结果分析：使用Image Pro Plus 6.0软件进行线粒体面积测量反映线粒体的肿胀程度；线粒体密度为每单位面积(μm2)胞质体中的线粒体数量。突触结果分析：使用Image Pro Plus 6.0图像处理软件测量突触前和突触后致密区厚度；突触数量等于单位面积(μm2)内的突触个数。

1.2.4 高尔基染色 实验动物进行深度麻醉后，快速取出脑组织，并用双蒸水快速冲洗脑组织表面的血液。按照FD Rapid GolgiStainTMKit说明书，把组织浸泡在溶液A和B等体积混合的浸渍中，次日更换新的浸渍液。将浸泡完全的脑组织转移到溶液C中，室温下保持3 d的黑暗处理。提前预冷切片机，将脑组织用吸水纸擦拭干净，置于样本盘上滴加双蒸水进行包被冰冻。在修块(Trim)模式下将包被冰冻完全的脑组织切成100～150 μm厚度的切片，用细毛笔将其展开于滴加C液的载玻片上。用双蒸水冲洗切片2次，4 min/次后进行染色，把切片置于溶液D∶溶液E∶双蒸水=1∶1∶2的混合液中碱化10 min，碱化结束之后用双蒸水冲洗切片2次，4 min/次，再在不同浓度的乙醇(500、750、950 mL/L)中进行梯度脱水，并在二甲苯中透明3次，每次4 min。最后树脂封片，避光晾干，拍照，进行数据分析。树突及树突棘分析：使用Image J软件对原始图片进行预处理，用Neuron J勾勒出整个神经元各级树突全貌，Sholl Analysis自动计算树突的长度和分支数；树突棘密度同样使用Image J软件进行自动计算。

2 结果

2.1 异氟醚对小鼠学习记忆的影响

本实验首先使用新物体识别评估了小鼠的学习记忆能力(图1)。与青年组相比，老年组对新物体的探索次数减少(P<0.05)，表现为学习记忆能力减弱。青年吸醚组与青年组相比，其对新物体的探索率显著性降低(P<0.05)；老年吸醚组与老年组以及老年吸醚组与青年吸醚组相比，对新物体的探索率均显著性下降(P<0.01)。异氟醚吸入后显著降低了青年和老年小鼠对新物体的探索欲望，提示异氟醚对小鼠的学习记忆能力会造成损伤，并且与青年吸醚组相比较，对老年小鼠的损伤更明显。

n=10, aP<0.05， bP<0.01。图1 新物体识别实验评估小鼠的学习记忆能力

2.2 异氟醚对小鼠海马CA1区神经元树突和树突棘的影响

神经元树突上有许多分支和功能性突起结构(树突棘)，是中枢神经系统突触功能可塑性的一个重要方面，与大脑的学习记忆功能密切相关，因此我们利用高尔基染色观察了神经元树突的形态变化(图2)。与青年组相比，老年组的树突长度和树突分支无显著性差异，但树突棘密度显著性减少(P<0.01)，相反，青年吸醚组的树突长度变短(P<0.05)，分支数量减少(P<0.01)，但树突棘密度无显著性差异。与老年组相比，老年吸醚组的树突长度、分支和树突棘数量均显著性降低(P<0.05)。此外，与青年吸醚组相比，老年吸醚组的树突长度和树突棘密度均减少(P<0.05，P<0.01)，但树突分支无显著性差异。该结果说明异氟醚会改变树突的形态变化，降低树突棘密度，这一损伤在老年吸醚组中更为明显。

A：树突的代表性图片；B：树突棘的代表性图片；C：树突长度统计学分析；D：树突分支的统计学分析； E：棘突密度统计学分析。 n=3,每组15个神经元； aP<0.05， bP<0.01。图2 高尔基染色观察小鼠海马CA1区神经元树突及树突棘的形态特征

2.3 异氟醚对小鼠海马CA1区线粒体精细超微结构的影响

本实验进一步利用透射电镜技术观察了小鼠海马CA1区线粒体的超微结构，特别是线粒体形态完整性的变化。结果显示，青年小鼠海马线粒体看起来无异常，没有肿胀或损伤的迹象，相比之下，老年组小鼠的线粒体嵴稍微向外扩张，区域分布不均。分别与青年组和老年组相比，青年吸醚组和老年吸醚组小鼠的线粒体均出现不同程度的肿胀，局部空泡化，而且线粒体双膜结构模糊，不可辨，嵴断裂、减少，并向外扩张；此外，较青年吸醚组，老年吸醚组的线粒体数量极少，基质染色过度苍白，细胞较不规则，胞质呈低电子密度，线粒体结构出现消融(图3)。

A：青年组；B：青年吸醚组；C：老年组；D：老年吸醚组。标尺为1.0 μm，n=3，绿色箭头指示为线粒体，×15 000。图3 透射电镜技术观察小鼠异氟醚吸入后海马CA1区线粒体形态学变化

2.4 异氟醚对小鼠海马CA1区线粒体形态学的影响

由图3电镜结果提示，异氟醚吸入后线粒体发生肿胀和区域分布不均，我们进一步对小鼠海马CA1区神经元胞体中的线粒体进行了详细的形态学测量分析。结果显示，与青年组相比，老年组小鼠的线粒体面积显著性增大(P<0.05)，线粒体密度显著性减少(P<0.01)，青年吸醚组的线粒体面积也增大(P<0.01)，但线粒体密度没有显著性差异。与老年组相比，老年吸醚组的线粒体面积增大，密度减少，均有显著性变化(P<0.05)。与青年吸醚组比较，老年吸醚组的面积也显著性增大(P<0.05)，密度减少(P<0.01，图4)。结果说明，异氟醚对青年和老年小鼠的线粒体形态均会造成不同程度的影响，且老年吸醚组线粒体的相关指标进一步发生变化。这提示异氟醚可能作用于线粒体并与年龄相关。

2.5 异氟醚对小鼠海马CA1区突触结构的影响

突触与记忆同样息息相关，接着，我们又利用透射电镜技术观察了突触的结构(图5)。结果显示，青年组小鼠的突触形态结构较完整，突触前膜蛋白和突触后致密蛋白均匀，突触前膜、突触间隙和突触后膜结构清晰、可辨。与青年组相比，老年组突触结构出现消融，数量较少，基质染色苍白，胞质电子密度较低；青年吸醚组与青年组相比，突触结构也出现消融，结构变得模糊、不可辨；老年吸醚组与老年组相比，突触数量较少，突触前膜中突触小泡受损。另外，相比于青年吸醚组，老年吸醚组的突触数量也减少，突触小泡受损严重，基质染色过度苍白，胞质呈低电子密度。

A：线粒体面积百分比(线粒体面积与总的细胞质面积的比值)；B：线粒体密度统计学。n=3，每组15个神经元； aP<0.05， bP<0.01。图4 异氟醚吸入后小鼠海马CA1区线粒体电镜图像形态学分析

A：青年组；B：青年吸醚组；C：老年组；D：老年吸醚组。标尺为1.0 μm，n=3，黄色箭头指示为突触结构，×15 000。图5 透射电镜观察小鼠吸醚后突触结构变化

2.6 异氟醚对小鼠海马CA1区突触形态学的影响

最后，我们对小鼠海马CA1区的突触超微结构进行了相关指标的定量分析(图6)，用突触前致密区厚度反映突触前膜蛋白的密度。结果显示，与青年组相比，老年组小鼠的突触数量显著性减少(P<0.01)，突触前膜和突触后膜致密区厚度无显著变化；吸入异氟醚之后，分别与青年组和老年组相比，青年吸醚组和老年吸醚组的突触数量无差异变化，但老年吸醚组的突触前膜和突触后膜致密区厚度均显著性降低(P<0.05，P<0.01)；而与青年吸醚组相比，老年吸醚组中小鼠海马CA1区突触数量和突触后膜致密区厚度均显著性减小(P<0.01)，但突触前致密区厚度无变化。该结果表明，异氟醚对小鼠海马CA1突触也会产生一定的损伤，且对老年小鼠的损伤更严重。

A：突触数量的统计图(单位面积μm2的突触个数)；B:突触前致密区厚度的统计图(反映突触前膜中蛋白密度)；C:突触后致密区厚度的统计图。n=3，每组15个神经元； aP<0.05， bP<0.01。图6 小鼠海马CA1区突触电镜图像形态学分析

3 讨论

异氟醚可以快速达到临床麻醉所需的遗忘、镇痛、催眠等诸多效果，是临床常用的吸入型麻醉剂[13]。但是越来越多的证据表明，异氟醚可能会引起大脑神经毒性，其中POCD是使用异氟醚麻醉后产生的最常见的并发症之一[14-16]。临床研究表明异氟醚诱发的POCD在老年患者中易出现，发病率高达25%～80%，远高于年轻患者[17]。动物实验表明，给18月龄的大鼠吸入12 mL/L异氟醚2 h，可以显著降低大鼠的空间操作能力，且这种损伤一直持续8周之久[18]。此外，据报道用14～17 mL/L异氟醚治疗2 h会降低大脑中的乙酰胆碱水平并导致大鼠的学习记忆障碍[19]。本研究给予不同年龄段的小鼠15 mL/L的异氟醚吸入2 h，结果显示，与青年组及老年组相比，青年吸醚组和老年吸醚组对新物体的探索率均显著性降低，且老年吸醚组的新物体探索率也显著低于青年吸醚组。该结果表明异氟醚会减弱小鼠的学习记忆功能，且对老年小鼠的作用更为明显。

海马与学习记忆密切相关，是认知功能重要的存储部位，与年龄相关性认知障碍有关[20]。突触是神经元之间进行信息传递的关键部位，突触可塑性是其发育及神经通路重塑的先决条件，是学习记忆的形态学基础。研究发现颞叶癫痫大鼠的空间学习记忆能力减弱，其海马区突触数量减少，突触结构模糊、不可辨，突触小泡受损严重，突触前膜膨大，突触后膜增厚[21]。另有研究发现热能限制可通过改善海马突触可塑性，缓解由D-半乳糖诱导的小鼠空间学习记忆能力损伤[22]。本实验通过电镜技术观察了青年和老年小鼠海马CA1区突触结构的差异及异氟醚暴露对其的影响，发现老年鼠较青年鼠的突触数量少，突触结构模糊、不可辨，突触前膜蛋白较稀疏，突触后致密区较薄，突触小泡受损严重，还发现吸醚组，尤其是老年吸醚组的这种损伤更严重。这一结果提示异氟醚会加剧突触结构损伤，而且这一作用与年龄有关。此外，树突棘的形态变化在大脑学习和记忆过程中同样重要[23]。研究发现Morris水迷宫定位航行训练后，小鼠的空间探索能力提高，海马区树突棘的密度也显著增加[24]；还有研究发现高脂饮食会降低大鼠的学习记忆功能，并且会导致大鼠海马树突棘密度损伤[25]。本研究进一步观察了异氟醚吸入后对青年和老年小鼠的树突棘影响，发现与青年小鼠比较，老年小鼠的树突形态发生改变，树突棘数量也减少；与青年或老年组相比，青年吸醚组和老年吸醚组存在明显的树突棘损伤，且老年吸醚组树突棘损伤更严重。以上结果提示，异氟醚对青年和老年小鼠海马的突触和树突形态均有一定的损伤作用，提示年龄老化是海马突触和树突形态损伤并导致学习记忆功能减退的原因之一，异氟醚则通过加剧这一损伤导致POCD。但异氟醚导致不同年龄阶段的小鼠突触损伤以及树突形态发生改变的具体机制还需后续进一步的探究。

海马线粒体在神经元突触中也发挥重要作用，突触形成、发育及功能行使离不开线粒体的能量支持[26-27]，研究表明异氟醚可通过引起海马线粒体功能损伤，导致海马神经元突触可塑性异常[28]。研究显示，15 mL/L异氟醚麻醉老年小鼠2 h可引起海马线粒体相关指标发生变化，包括电子传递链复合物Ⅰ和Ⅲ酶活性降低、ROS水平表达增加、ATP水平和膜电位下降，最终导致线粒体能量代谢异常[29]。本研究比较了青年和老年两个年龄段的小鼠在15 mL/L异氟醚中暴露2 h后线粒体形态结构变化，发现与青年小鼠相比，老年小鼠线粒体表现出肿胀，面积增大，密度降低，数量减少，区域分布不均匀等损伤；异氟醚暴露后，与其对照相比，异氟醚破坏线粒体形态结构并造成线粒体面积增大，密度减少，且在老年吸醚组中更明显。这一结果表明，线粒体是易受年龄影响的细胞器，因此，老年小鼠海马线粒体形态和结构受损；异氟醚吸入后，青年和老年小鼠的线粒体在形态上均出现了一定程度的破坏；此外，与青年吸醚组相比，老年吸醚组的线粒体形态破坏更为严重，说明老年小鼠线粒体更容易受到异氟醚的影响，线粒体可能是异氟醚作用的靶细胞器之一，但异氟醚导致线粒体形态破坏的具体机制及其与年龄的相关性还需后续进一步的实验探究。

综上所述，本研究观察了异氟醚对不同年龄段小鼠认知功能、海马线粒体、突触结构及树突形态的影响，发现异氟醚会抑制小鼠的学习记忆功能，导致线粒体和突触结构损伤并改变神经元树突形态，而这一现象在老年小鼠中表现更为明显，这可能是临床上使用麻醉剂导致POCD发生的形态学机制之一。然而异氟醚对老年小鼠的损伤具体是年龄本身的影响更大还是异氟醚造成的影响更大，本研究还尚得不出明确的结论，后续的实验会设计多重因素比较不同浓度的异氟醚对不同年龄段小鼠的影响。