根际细菌LK2-3 对黄瓜枯萎病的生物防治作用

张婉菊，谢太震，陈梦多，王艺茹，沈虎生，何梦菡，朴凤植，申顺善

（1.河南农业大学植物保护学院 郑州 450002； 2.河南农业大学园艺学院 郑州 450002）

黄瓜枯萎病是由无性态真菌尖孢镰孢菌黄瓜专化型（f. sp.）引起的一种毁灭性土传病害，在黄瓜整个生育期均能产生危害，在露地和保护地栽培中均可发生，尤其是在黄瓜连作地发生更为严重。目前，黄瓜枯萎病的防治以化学防治为主，但使用化学农药容易产生抗药性而导致防效降低，且化学农药易残留，容易引起环境污染和人畜安全等问题。植物病害的生物防治具有安全、无毒、环保等特点，弥补了植物病害传统防治方法的缺陷，在农业生产上具有十分广阔的应用前景，尤其在蔬菜病害防治方面优势显著。目前，利用生防细菌防治黄瓜枯萎病的研究比较活跃，已报道的黄瓜枯萎病生防细菌主要有解淀粉芽孢杆菌（）、枯草芽孢杆菌（）、蜡样芽孢杆菌（）等芽孢杆菌属和铜绿假单胞菌（）、荧光假单胞菌（）、弗雷德里克斯堡假单胞菌（）等假单胞菌属。如，解淀粉芽孢杆菌（.）SF1103 和枯草芽孢杆菌（.）SF1104 对黄瓜枯萎病菌具有较强的拮抗能力，能有效防治黄瓜枯萎病，同时对黄瓜的生长有促进作用；蜡样芽孢杆菌（.）Y3F 能分泌抑制病原菌生长的活性物质，显著降低黄瓜根际土壤真菌和尖孢镰孢菌数量；铜绿假单胞杆菌（.）BA5 对黄瓜枯萎病菌菌丝抑制率达58.33%，能有效防治黄瓜枯萎病；荧光假单胞杆菌（.）对黄瓜枯萎病菌菌丝抑制率达87.04%，降低了黄瓜枯萎病发病率；弗雷德里克斯堡假单胞菌（.）33-1 对黄瓜枯萎病具有很好的防治效果，防效达86.95%，同时对黄瓜具有促生作用。

目前，在生产上应用于黄瓜枯萎病生物防治的高效生防菌株还是有限。笔者从番茄根系分离筛选出生防细菌LK2-3，研究其对黄瓜枯萎病菌的抑制效果，确认其对黄瓜枯萎病的防治效果、对黄瓜的促生效果及其根际定殖能力，并对其进行鉴定，为黄瓜枯萎病的生物防治提供生防资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株LK2-3 为2020 年分离自河南省驻马店采集的健康番茄根系，采用逐步提高诱导浓度的方法获得稳定抗利福平（100 μL·mL）的菌株，保存于-80 ℃超低温冰箱；黄瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌黄瓜专化型（.f. sp.）由河南农业大学植物保护学院植物病害生物防治研究室提供；供试黄瓜品种为寒育6 号，是河南豫艺种业科技发展有限公司选育的抗枯萎病品种；供试培养基为TSA 培养基（TSB 30 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL）、PDA 培养基（土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL）、PDB 培养基（土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL）和PDK 培养基（PDB 20 g，蛋白胨10 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL）。

1.2 方法

试验于2021 年1—12 月在河南农业大学植物保护学院植物病害生物防治研究室进行。

1.2.1 LK2-3 菌悬液的配制 将LK2-3 在TSA 培养基上培养72 h 后，用0.1 mol·LMgSO溶液配制成10cfu·mL的LK2-3 菌悬液。

1.2.2 尖孢镰孢菌孢子悬浮液的配制 将在PDA培养基上培养的尖孢镰孢菌菌饼接种到PDB 培养基，在恒温摇床（28 ℃，160 r·min）培养5 d，然后用无菌水稀释配制成1×10孢子·mL的孢子悬浮液。

1.2.3 LK2-3对黄瓜枯萎病菌的抑制活性测定 采用平板对峙法测定LK2-3 对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制效果。将尖孢镰孢菌菌饼放在PDK 培养基平板中央，在距离菌饼25 mm 处接种LK2-3，置于28 ℃培养箱中培养5 d 后调查抑菌带大小。采用悬滴法测定LK2-3 对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制活性。取等量的LK2-3 菌悬浮液（10cfu·mL）和尖孢镰孢菌分生孢子悬浮液混合均匀，取20 μL 滴到凹玻片上，置28 ℃恒温培养箱里保湿培养，每隔2 h 在显微镜下观察分生孢子萌发情况，每次共观察3 个视野，每个视野大概100个分生孢子，以无菌水和尖孢镰孢菌分生孢子悬浮液混合作对照。

孢子萌发率/%= 萌发孢子数/调查孢子总数×100；

孢子萌发抑制率/%=（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率×100。

1.2.4 LK2-3的防病效果和促生效果测定 采用盆栽试验测定LK2-3 对黄瓜枯萎病的防治效果和对黄瓜的促生效果。试验设4 个处理，即清水处理（CK）、LK2-3 处理、枯萎病菌处理（FOC）、枯萎病菌和LK2-3 处理（FOC+LK2-3），随机区组设计，每处理3 次重复，每个重复15 株。将2 片真叶的黄瓜苗移栽至花盆（直径9 cm），用LK2-3 菌悬液（10cfu·mL）进行灌注处理（100 mL·株），然后沿花盆边缘灌注接种黄瓜枯萎病菌孢子悬浮液（10 mL·株），在育苗室培育15 d 后，按照分级标准调查枯萎病发病程度，并计算病情指数和防治效果。同时，测定黄瓜株高、茎粗、叶鲜质量、叶干质量、根鲜质量、根干质量等黄瓜生育指标。调查黄瓜枯萎病分级标准：0 级为植株正常生长，不发病；1 级为植株有≤1/4 的叶片萎蔫；2 级为植株有＞1/4、≤2/4 的叶片萎蔫；3 级为植株有＞2/4、≤3/4的叶片萎蔫；4 级为植株萎蔫死亡。

病情指数=∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）×100；

防治效果/%=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。

1.2.5 LK2-3的根际定殖密度测定 采用稀释涂布平板法测定LK2-3 的根际定殖密度，用LK2-3 菌悬液（10cfu·mL）进行灌根处理（100 mL·株）15 d 后测定LK2-3 在黄瓜根系和根际土壤的定殖密度。测定根系的定殖密度：轻轻拔出黄瓜根系，用流水冲洗干净，吸干根表面的水分，称取1 g 根系，研磨后用0.1 mol·LMgSO溶液稀释一定浓度涂抹在添加利福平的TSA 培养基平板上，置于28 ℃恒温箱培养48 h，待形成菌落，检测菌落数并推算出在黄瓜根系的LK2-3 定殖密度；测定根际土壤中的定殖密度：取1 g 根际土壤，用0.1 mol·LMgSO溶液稀释一定浓度涂抹在添加利福平的TSA 培养基平板上，培养同上，待形成菌落，检测其定殖密度。

1.2.6 LK2-3的鉴定 LK2-3 菌株的形态特征及生理生化特性主要参考《伯杰氏细菌学鉴定手册》，按照常规细菌学方法进行鉴定。将LK2-3 菌株在TSA 培养基上划线培养72 h 后，观察单菌落的形态、颜色、大小、透明度、光泽及边缘特征等。采用革兰氏染色法观察LK2-3 菌体形态。

16S rRNA 序列同源性分析：将LK2-3 在TSA培养基上培养2 d，挑取细菌单菌落提取RNA，采用通 用 引 物27 f（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG- 3’）和 1492 r（5’- TACGGHTACCTTACGACTT-3’）进行PCR 扩增，PCR 扩增采用50 μL反应体系（DNA：1 μL，Primer：各1 μL，Mix：25 μL，ddHO：22 μL），PCR 反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 个循环后72 ℃延伸10 min。PCR 产物送生物公司测序，测序结果利用NCBI BLAST进行序列分析，并采用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

1.3 数据分析

采用Excel 2003 和SPSS 26.0 软件进行数据分析，以最小显著差数法（LSD）分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 LK2-3对黄瓜枯萎病菌的抑制活性

平板对峙试验结果显示，LK2-3 在PDK 培养基上对尖孢镰孢菌形成明显的抑菌带，其直径为0.55 cm（图1）。黄瓜枯萎病菌孢子萌发试验结果表明，在无菌水中培养2 h 时分生孢子萌发率为37.50%，培养8 h 时萌发率达到81.13%，而LK2-3处理的分生孢子培养2 h 时萌发率为16.63%，培养8 h 时萌发率为41.67%，培养8 h 时对分生孢子萌发抑制率达48.64%（图2）。说明LK2-3 菌株对尖孢镰孢菌的菌丝生长和孢子萌发均具有明显抑制效果。

图1 LK2-3 对尖孢镰孢菌菌丝生长的抑制效果

图2 LK2-3 对尖孢镰孢菌孢子萌发的影响

2.2 LK2-3对黄瓜枯萎病的防治效果

盆栽试验结果表明，黄瓜接种枯萎病菌后植株生长明显受到抑制，处理10 d 时开始表现萎蔫症状，到15 d 时病情指数达到50.00，而LK2-3 处理的黄瓜15 d 时生长仍然良好，枯萎病病情指数仅为5.56，LK2-3 处理对黄瓜枯萎病具有显著的防治效果，防治效果达到88.89%（表1）。由图3 也可明显看出，处理15 d 时LK2-3 对黄瓜枯萎病具有明显的防治效果。

图3 LK2-3 处理15 d 对黄瓜枯萎病的防治效果

表1 LK2-3 处理对黄瓜枯萎病的防治效果

2.3 LK2-3对黄瓜的促生效果

盆栽试验结果显示，LK2-3 处理对黄瓜植株生长具有显著的促生效果。LK2-3 处理15 d 后，黄瓜株高和茎粗分别为7.27 cm 和3.55 mm，比对照增加32.18%、54.35%；LK2-3 处理的黄瓜叶鲜质量和干质量分别为6.36 g·株和0.82 g·株，比对照增加160.66%和128.61%；LK2-3 处理的黄瓜根鲜质量和干质量分别比对照增加480.00%和223.33%。接种黄瓜枯萎病菌（FOC）的条件下LK2-3 处理同样具有显著的促生效果（表2）。说明LK2-3 处理不仅能够防治黄瓜枯萎病，而且对黄瓜植株生长和根系发育也具有明显的促进作用，由图3和图4 也可看出LK2-3 处理明显促进了黄瓜地上部生长和根系发育。

表2 LK2-3 对黄瓜的促生效果

图4 LK2-3 处理15 d 对黄瓜的促生效果

2.4 LK2-3的定殖密度

进行盆栽试验测定LK2-3 根际定殖密度的结果，处理15 d 后LK2-3 在黄瓜根系和根际土壤的定殖密度分别达到1.44×10cfu·g和1.12×10cfu·g（表3），表明LK2-3 在黄瓜根系和根际土壤具有稳定的定殖密度，为其发挥促生防病作用奠定了基础。

表3 LK2-3 在黄瓜根际定殖密度

2.5 LK2-3的鉴定

LK2-3 在TSA 培养基上产生白色、不透明、表面不光滑、边缘不规则的菌落（图5）。LK2-3 的菌体为直杆状，革兰氏阳性，产芽孢，在5～50 ℃范围内均能生长，最高耐盐浓度为11%，可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、丙酸盐、丁酸盐和山梨醇，硝酸盐还原反应、明胶液化、淀粉水解反应、过氧化氢酶试验均呈阳性，亚硝酸盐还原反应呈阴性（表4）。另外，以LK2-3 菌株总RNA 为模板，PCR 扩增出的16S rRNA 长度约为1.5 kb，对其序列进行NCBI BLAST 比对，结果显示，与枯草芽孢杆菌16S rRNA 序列同源性达到99%。利用MEGA 软件构建其系统发育树，结果显示，与枯草芽孢杆菌（LC506466.1）在一个分支，其支持度为99%（图6）。因此，根据其形态特征、生理生化特性和16S rRNA 序列同源性分析，将LK2-3 菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（）。

图6 LK2-3 的系统发育树

表4 LK2-3 的形态特征和生理生化特性

图5 LK2-3 的培养形态

3 讨论与结论

黄瓜枯萎病菌是由厚垣孢子在土壤中长期存活，土壤中的菌丝和厚垣孢子萌发从植物根或根茎部侵入，在维管束内寄生的一种系统性病害。在枯萎病菌的生活史中能够抑制任何一个发育阶段都是防治枯萎病的有效途径。圆圆等发现，生防菌S-101 不仅能抑制黄瓜枯萎病菌菌丝生长，又能抑制孢子萌发，从而抑制病原菌的无性繁殖；李晶等发现，枯草芽孢杆菌B29 菌株不仅能抑制黄瓜枯萎病菌菌丝生长，又能抑制孢子萌发，对黄瓜枯萎病有显著的防治效果。本研究结果表明，LK2-3 菌株能够抑制黄瓜枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发，能够有效切断枯萎病菌的繁殖，有效防治黄瓜枯萎病，同时，LK2-3 对黄瓜植株生长表现明显的促进作用，显示出良好的生防潜力。

生防菌的根际定殖能力是其发挥效果的前提，其在植物根际定殖能力的强弱及稳定性是决定生物防治成功与否的关键，决定了其潜在生防作用的大小。生防菌的定殖包括两个方面，一是能够在植物根际生存下来，二是能适应植物根际环境而大量繁殖。连玲丽等发现，枯草芽孢杆菌（.）EN5 可以在其自然寄主番茄的根、茎及根际土壤中稳定定殖，显著改善根际土壤微生态环境，抑制病菌繁殖；王晶晶等发现，普城沙雷菌（）K9-3 和绿针假单胞菌（）L14-2 均具有良好的根际定殖能力，能有效防治烟草黑胫病；刘锦霞等发现，枯草芽孢杆菌（.）SW11 表现出很强的抗逆和复杂生态环境适应能力，既可以在番茄根际土壤中定殖生存，又可以定殖于番茄植株的各个部位，成为番茄植株及其根际的有益微生物种群之一，显示了良好的开发应用潜力。本研究结果表明，LK2-3 菌株在黄瓜根系和根际土壤成功定殖，且在根系和根际土壤能够保持10cfu·g和10cfu·g的定殖密度，具有良好的定殖能力。

芽孢杆菌因具有生长速度快、营养需求简单、有较强的耐热性及抗逆性、在植物表面易于存活与繁殖、制剂的稳定性良好等优点成为植物病害生物防治中研究应用最多，同时靶标病害种类也比较多的一类生防细菌。如，蜡质芽孢杆菌（.）AR156 对水稻纹枯病具有较好的防治效果，侧孢芽孢杆菌（.）B113 对番茄早疫病有较好的防治效果，多粘类芽孢杆菌（）CF05 对铁皮石斛细菌性叶斑病具有防治效果，枯草芽孢杆菌（.）B-33 对稻瘟病菌具有抑制作用。本试验中筛选的LK2-3 是枯草芽孢杆菌（.），能产生芽孢，具有较强的抗逆性，在黄瓜枯萎病防治方面具有很好的应用潜力。

综上所述，枯草芽孢杆菌LK2-3 对枯萎病菌的抑菌活性较高，具有良好的定殖能力，可有效防治黄瓜枯萎病，可促进植物生长，有较好的应用潜力。生防细菌的防病促生机制是多方面的，是生防细菌的推广应用的基础。下一步需要深入研究LK2-3 菌株的防病促生机制，并进一步探究其高效利用技术，为黄瓜枯萎病的绿色防控提供重要的理论和技术支撑。