Th17/Treg 失衡在肝性脑病发病中的作用及与AST、ALT 和血氨的相关性

计钰亮，朱婷婷，杨君寅

肝性脑病（HE）是由于各种急慢性肝病导致的肝功能障碍或门体分流异常所引发，常伴有不同程度的代谢紊乱和神经精神异常症状，是各种肝病发展至终末期常见的并发症，也是导致终末期肝病患者死亡的主要原因[1]。HE 患者可表现为不同程度的性格改变、行为异常等，随着疾病进展甚至出现谵妄、嗜睡及昏迷等意识障碍，加剧患者的肝病进程，对患者的预后造成不利影响[2]。关于HE的发病机制至今尚未完全阐明，目前国内外较为公认的机制包括较为经典的氨中毒学说、神经递质的改变、大脑星形胶质细胞早衰以及血脑屏障通透性的改变等[3-4]。近年随着研究的深入，免疫因素、炎性应激反应等机制也被认为与HE 的发生和发展关系密切[5]。辅助型T 淋巴细胞（Th17）和调节型T 细胞（Treg）是CD4+T 淋巴细胞的分化表型，其在机体免疫调节中起着重要作用，并参与机体炎症的发生及发展。有研究表明，高氨血症与炎症反应可相互作用，诱导HE的发生和发展，Th17/Treg失衡反映患者免疫功能失调，而且患者血氨水平升高可诱导星形胶质细胞和小胶质细胞活化，进一步释放脑源性炎性因子，引发神经系统炎症[6]。为进一步明确HE 患者Th17/Treg失衡与病情的关系，本研究将对HE 患者Th17/Treg 水平和肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和血氨的关系进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年4月至2021年7月中国人民武装警察部队海警总队医院收治的肝病患者179例。HE诊断标准参照《中国肝性脑病诊治共识意见》[7]中的标准。排除标准：（1）代谢性脑病；（2）神经系统其他病变；（3）精神障碍患者；（4）血管性痴呆及脑萎缩等。按照是否发生HE 分为HE 组（n=79）和无HE 组（n=100）。HE 组男45例，女34例；年龄49 ～71岁，平均（60.1±8.4）岁；病程8 ～17年，平均（12.61±3.35）年；病因：酒精性肝硬化36例，肝炎后肝硬化43例；HE分级[8]：轻度23例，中度27例，重度29例。无HE 组共100例，其中男69例，女31例；年龄48 ～72岁，平均（60.9±8.8）岁；病程8 ～19年，平均（13.02±3.64）年；病因：酒精性肝硬化47例，肝炎后肝硬化53例。两组一般差异无统计学意义（P ＞0.05）。本研究患者家属知情同意且签署知情告知同意书，本研究通过医院医学伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 Th17/Treg 水平检测 采集患者晨起空腹12 h 外周静脉血10 ml，血液中加入Hank’s 缓冲液和淋巴细胞分离液，经2 000 r/min离心处理20 min，将细胞分层后吸取最上层的淋巴细胞层得到外周血中单个核细胞；使用PBS 缓冲液洗涤细胞2 次，每管加入2 ml permeabilization buffer，室温避光孵育15 min，离心处理后弃上清液；继续加入100 l permeabilization buffer 室温孵育15 min，室温下避光反应30 min，使用PBS 溶液洗涤2 次，1 000 r/min 离心处理5 min 弃上清液；加入2 ml 流式染色液将细胞沉淀重悬，于30 min 内使用流式细胞检测仪（赛默飞Attune NxT 流式细胞仪）分别测定Th17 和Treg 水平，并计算Th17/Treg。检测过程中使用的细胞表面染色荧光标记的单抗试剂盒由美国eBioscience 公司生产，严格按照试剂盒和检测仪操作说明进行测定。

1.2.2 肝功能指标和血氨 采集患者晨起空腹静脉血5 ml，室温静置30 min 后经3 500 r/min 离心处理10 min，使用全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，BS-350E）检测ALT、AST 和血氨水平。

1.3 统计方法 采用SPSS 21.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t 检验；多组比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用2检验；相关性分析采用Pearson 相关分析法和Spearman 相关分析法，并采用受试者工作特征曲线（ROC）分析各指标的价值。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Th17、Treg 和肝功能指标比较 HE 组Th17、Th17/Treg、AST、ALT及血氨水平均高于非HE 组，Treg 水平低于HE 组（均P ＜0.05），见表1。

表1 组Th17、Treg 和肝功能指标比较

2.2 不同严重程度HE 患者Th17、Treg和肝功能指标比较 HE 重度组Th17、Th17/Treg、AST、ALT 及血氨水平均高于轻度组和中度组，Treg 水平低于中度组和轻度组（均P＜0.05）；中度组Th17、Th17/Treg、AST、ALT 以及血氨水平均高于轻度组，Treg水平低于轻度组（均P＜0.05）。见表2。

表2 不同严重程度HE 患者Th17、Treg 和肝功能指标比较

2.3 Th17、Treg 和Th17/Treg 水平与HE 严重程度及肝功能相关指标的关系

Th17/Treg 与AST、ALT、血氨和病情严重程度均呈正相关（均P ＜0.05），见表3。

表3 Th17、Treg 和Th17/Treg 水平与HE 严重程度以及肝功能相关指标的关系

2.4 Th17/Treg 和肝功能指标评估发生HE 的价值 Th17/Treg、血氨、AST 和ALT 用于评估发生HE 均有较高效能，其中上述指标联合诊断效能最高，其约登指数为0.734，AUC为0.823，敏感度、特异度分别为90.58%、92.03%。见表4。

表4 Th17/Treg 和肝功能指标评估发生HE 的价值

2.5 Th17/Treg 和肝功能指标评估HE严重程度的价值 Th17/Treg、血氨、AST 和ALT 用于评估HE 严重程度具有较高效能，其中血氨用于评估HE 严重程度的效能最高，其约登指数为0.677，AUC 为0.810，敏感度、特异度分别为89.47%、78.56%。见表5。

表5 Th17/Treg 和肝功能指标评估HE 轻度与中重度的价值

3 讨论

HE 是各种肝病发展至终末期的常见并发症，其多见于肝硬化失代偿期和重型肝炎患者，临床表现和预后情况与发病原因、肝细胞的损伤程度等密切相关，患者可出现不同程度的行为异常、精神异常或意识障碍等，且死亡率较高[9-10]。当前HE 的发病机制尚处于大量研究论证阶段，并无明确的标准。明确影响疾病进展的因素对于肝脏原发疾病和HE的及时诊治具有重要意义。肝脏疾病的发生和发展以及转归与结局与免疫细胞及各类细胞因子的作用关系密切，其中Th17 和Treg细胞能够相互作用、相互拮抗，达到平衡状态，在维持免疫内环境的稳定中具有重要的作用，其参与了多种免疫性疾病甚至是肿瘤的发生和发展[11]。本研究结果显示HE 组Th17、Th17/Treg和肝功能指标AST、ALT 和血氨水平均高于非HE 组，Treg 水平低于非HE 组；这说明HE 患者存在Th17/Treg 失衡，肝功能指标升高。分析原因为Th17 主要参与肝脏炎症反应过程，而Treg 细胞主要参与机体免疫应答，二者的分化主要取决于肝脏病变微环境中的免疫、炎性细胞因子水平，HE患者多为肝硬化失代偿期或重症肝炎后期，此时机体的Th17水平和白细胞介素-6 的水平明显升高，参与肝脏的炎性病变，加剧肝脏损伤[12]。随着肝脏炎性病变的加重，Th17 水平增加加剧肝脏炎性反应，导致Treg 细胞介导的免疫应答受到抑制，Treg 通过下调以维持Th17/Treg 的平衡，并调节机体免疫，进而避免过度的肝细胞损伤，故HE 患者Th17/Treg 高于非HE 组。而HE患者多伴有肝功能衰竭、肝细胞损伤和凋亡严重，侧支循环的建立，导致氨在门体分流时不经肝脏代谢直接进入体循环，造成血氨水平升高，其代谢产物进入脑组织导致大脑功能的紊乱，因此HE组患者肝功能指标和血氨水平升高[13]。

本研究结果显示随着疾病进展HE重度组患者Th17/Treg 及肝功能指标均较轻度组和中度组升高，Th17/Treg随着病情进展而进一步增加，与HE 进程呈正相关，与肝功能指标AST、ALT 和血氨也呈正相关；这说明Th17/Treg 失衡加剧HE 进展和肝功能损伤。分析原因为Th17 细胞是一种高度促炎的Th 细胞亚型，肝性脑病患者肝功能损伤严重时Th17 水平明显上升，Treg 细胞出现免疫性下调，而在外周血中，Th17 其能够激活骨髓中中性粒细胞，进而诱导未成熟的单核细胞迁移至血液中，中性粒细胞在Th17 的募集下增加可提高蛋白酶的活性，导致炎性细胞诸如巨噬细胞和单核细胞等释放增多，使髓鞘和轴突持续受到损伤，且Th17 已被证实更容易通过血脑屏障，表现出神经毒性作用[14]。而血脑屏障的破坏是中枢脱髓鞘病变形成的关键，肝功能衰竭患者的转化增长因子也能够使血脑屏障的通透性增加，使得大量炎性介质通过血脑屏障进入脑实质，引发神经毒性反应，出现一系列的神经系统病理表现[15]。故随着肝功能损伤的进一步发展，HE 患者Th17/Treg 失衡越加严重，而随着Th17 和Treg 比例失衡的加剧，血脑屏障破坏严重，神经毒性反应加剧，又促进了HE 的进程。而HE 患者病情与肝功能衰竭的程度密切相关，随着肝细胞的损伤，AST、ALT 等肝功能指标也明显升高，血氨在肝脏的代谢受到影响，水平明显升高，故随着肝功能的进一步损伤，Th17/Treg失衡并诱导炎性反应通过影响血脑屏障参与脑实质的病变中，与HE 的进展和肝功能损害有关。

本研究结果显示Th17/Treg 联合AST、ALT 及血氨共同评估肝病患者是否出现HE 的价值较高，且对于鉴别HE严重程度也具有较高的效能。分析原因为在肝脏病变早期，Th17 细胞具有一定的清除病毒，延缓感染进程的作用，但随着炎症进展，Th17 大量表达和分化导致促炎因子分泌增加，严重影响Th17/Treg平衡，促炎因子大量释放导致肝脏细胞损伤加剧，诱发肝功能衰竭和恶化，随着患者CD4+、CD25+Treg 细胞数量的降低，细胞毒性T 淋巴细胞的扩增失去控制，引发CD8+细胞毒性T 细胞反应，导致大量肝细胞的坏死，加剧肝衰竭的进程和HE 的风险[16]。另一方面，Th17 细胞还可以通过分泌细胞因子包括白细胞介素-17A、白介素-6、白介素-21 等而对血脑屏障造成免疫攻击，影响血脑屏障的完整性间接的作用于血脑屏障，加重神经脱髓鞘病变和HE 进程[17]。另外，HE 患者由于肝功能损伤严重导致血氨在体内产生蓄积，其代谢产物随着体循环进入大脑，增加氧化应激和渗透压，导致星形胶质细胞的水肿，使星形胶质细胞的功能受损，具体表现为异常增殖甚至是细胞凋亡，并释放脑源性炎性因子引发神经炎症，加重脑细胞损伤和HE的神经症状[18]。