miR-92b-3p靶向GDF11调控骨髓间充质干细胞*

牟朋林 麦彩园 王 斌

1 广州新海医院，广东省广州市 510080； 2 广东省妇幼保健院； 3 佛山市三水区人民医院

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种代谢性疾病，临床特征为骨量及质量、骨强度下降为主[1]。我国50岁以上女性患病率超过了20%[2]。成骨细胞(Osteoblast，OB)和破骨细胞(Osteoclast，OC)调节代谢失衡，影响钙质吸收利用，导致骨量减少、骨骼破坏，引起疼痛、骨折等问题[3]。miRNA是一种非编码RNA，在肿瘤、骨与代谢等多个领域被研究[4]。近年来，miRNA在BMSCs和成骨中关注越来越多。研究表明miR-92b-3p可促进成骨分化[5]。生长分化因子GDF11(Growth differentiation factor 11)是属于转录生长因子TGF-β超家族的一名成员。已知的TGF家族成员参与调控骨改建过程，如TGF-β促进破骨形成、抑制成骨分化[6]。而GDF11是否可以作为miR-92b-3p的靶点对BMSCs作用还不清楚。本文探讨miR-92b-3p靶向GDF11对BMSCs调节成骨的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本研究方案按照1964年赫尔辛斯基宣言规定，由新海医院的动物试验伦理委员会审查通过。本研究选择从广州赛业生物科技有限公司购买糖尿病骨质疏松大鼠模型-SPF wistar大鼠10只。大鼠被处死，收集股骨近端1/3处的骨髓腔组织。

1.2 仪器与试剂 实时PCR仪、流式细胞仪：Progmega公司，美国。荧光素酶报告检测系统：Bio-Rad公司，美国。RNA提取试剂盒：Takara铎洋生物有限公司，中国。ALP、茜素红染色试剂盒、载体：Takara公司，中国。DMEM培养基、成骨分化培养液：Bio-Rad公司，美国。胎牛血清、质粒、Lipofectamine 2000、293Tcell：Invitrogen公司，美国。质粒抽提试剂盒：Sigma公司，美国。模拟物及抑制物、RNAiMAX、Trizol试剂：QIAGEN公司，德国。

1.3 实验方法

1.3.1 BMSCs细胞培养：从髓腔抽取骨髓4ml，建立BMSCs的体外培养体系，予以成骨分化：将骨髓与DMEM培养液混合。室温离心，去上清。重悬细胞，将悬液缓慢注入Percoll分离液，离心，吸取中间细胞层，加入培养基，吹打获得含有BMSCs细胞的悬液。于培养箱进行培养，换液，显微镜下观察。胰酶消化，调节细胞浓度至2×105个/ml，继续细胞培养板内培养。待细胞融合达到70%～80%，传代培养。取第3代BMSCs，加入成骨诱导液诱导，提取RNA，进行qPCR。

1.3.2 qPCR：取样品，移至RNAiso Plus液EP管，混合，加入氯仿，混合离心。上层加异丙醇，然后离心。移去上清，加入乙醇。离心弃去上清，加入无RNA酶水，读取OD值。参照反转录试剂盒反转录将RNA合成cDNA。按以下条件扩增：95℃20s，95℃1s，60℃20s，40cycles。计算所有样品的Ct值，以2-ΔΔCt表示相对表达量。

1.3.3 碱性磷酸酶(ALP)染色：根据ALP程序说明，测试ALP活性。收集BMSCs并裂解。离心，收集上清液，然后用对硝基苯磷酸酯孵育。酶标仪测OD值。

1.3.4 茜素红染色：将PMOP细胞用PBS洗涤，多聚甲醛固定，茜素红溶液染色。蒸馏水洗后行细胞照相。检测细胞钙沉积，以此反应成骨细胞钙化。

1.3.5 细胞转染：购买miR-92b-3p模拟物(mimics)和相应的阴性对照(NC group)、miR-92b-3p 抑制物(inhibitor)和对照(NC)。细胞铺于孔板中，融合，吸出培养液，PBS缓冲液冲洗，更换养液，用Opti-MEM培养液将质粒分别稀释，取对应组的RNA加入于转染试剂中，孵育加入培养液中，培养后换普通培养液，继续培养行表达量验证。miR-92b-3p过表达48h后换成骨诱导培养基行成骨诱导培养。在诱导的7、14、21d 分别检测ALP和茜素红染色。共分为四组：BMSC组、BMSC+成骨分化液组、BMSC+过表达miR-92b-3p对照组、BMSC+过表达miR-92b-3p组。诱导第7天用qPCR检测各组BMSCs成骨特异性因子Runx2及靶基因GDF11的表达。

1.3.6 双重荧光素酶报告基因检测：利用targetscan网站预测，miR-92b-3p可能结合的靶位点：GDF11。进行荧光素酶结合试验，构建含miR-92b-3p结合位点的质粒命名为pMIR-GDF11-WT(野生型)、pMIR-GDF11-MT(突变型)。进行miR-92b-3p转染，将细胞接种于24孔板中，并用Lipofectamine 2000将pMIR-GDF11-WT/pMIR-GDF11-MT载体与miR-92b-3p mimics共转染至293T细胞。48h后用荧光素酶检测。

2 结果

2.1 qPCR验证miR-92b-3p过表达 将模拟物过表达转染48h的细胞收集并提取RNA，后进行qPCR实验示模拟物过表达转染后细胞miR-92b-3p表达水平显著上升：相对值由2.21±0.24上升至6.49±1.21(P<0.05)。

2.2 过表达miR-92b-3p后成骨能力升高 传代细胞行miR-92b-3p过表达转染，行ALP和茜素红染色，过表达miR-92b-3p后随着诱导时间增加，ALP水平逐渐上升，茜素红染色结节沉积逐增加(图1～2)。qPCR显示Runx2表达：BMSC+成骨分化液组显著上升，BMSC+过表达miR-92b-3p组显著上升；GDF11的表达：BMSC+成骨分化液组显著下降，BMSC+过表达miR-92b-3p组显著下降(图3)。

图1 过表达miR后成骨 图2 过表达miR后ALP

图3 qPCR检测Runx2和GDF11的表达

2.3 miR-92b-3p与GDF11结合位点验证 使用targetscan网站找到miR-92b-3p与GDF11的结合靶点，如图4所示。荧光素酶报告基因示miR-92b-3p可显著抑制pMIR-GDF11-WT的荧光素酶活性，而不影响pMIR-GDF11-MT活性(图4～5)。

图4 GDF11的mRNA与miR-92b-3p结合位点

图5 荧光素酶报告实验

3 讨论

糖尿病性骨质疏松症(Diabetic osteoporosis,DOP)是一种常见的由糖尿病引发的慢性代谢性骨病。发病率和病死率逐年升高的,迫切使临床研究新的方法治疗。本文研究[7]。BMSCs是一种“多能细胞”,可以分化为成骨、软骨等细胞，研究表明在OP状态时，BMSCs分化紊乱,成骨能力减低[8]。miRNA是一种非编码单链RNA，大量存在于BMSCs内，影响各类细胞包括骨细胞的增殖[9-10]。miR-92b-3p通过靶向SGK3抑制C2C12细胞增殖并阻止C2C12细胞迁移[11]。白藜芦醇通过增加miR-92b-3p的表达减弱NADPH氧化酶4 /核因子κB途径，对雌激素缺乏症引起的骨质疏松起保护作用[12]。近年来，在OP中miRNA调控BMSCs分化已成为热点, miR-92b-3p可抑制DKKl进而促进在人脐带间充质干细胞的成骨分化[5]。

GDF11可通过激活PI3K/Ak通路抑制糖尿病小鼠BMSCs凋亡[13]。既往研究表明，GDF11的缺失会引起骨骼相关的疾病:如GDF11敲除小鼠表现了骨骼相关疾病；抑制GDF11的功能会导致骨量的增加；GDF参与调控牙本质的分化并修复牙本质[6]。一些研究认为，GDF11能作为抗衰老因子，血清中的GDF11水平随着年龄的增加而减少，GDF11能修复老年引起的大脑、骨骼肌及心肌干细胞的功能紊乱；然而，另一些研究得出完全相反的结论，认为血清中GDF11水平并不随着年龄增加而增加，提高GDF11水平是老年相关疾病的危险因素，对小鼠全身用rGDF11处理抑制了骨骼肌的再生肌并不能修复老年相关的病理性心肌肥大[6]。这些相悖的研究结果，加上以往对于GDF11作为骨改建的调控因子的体内机制尚不明确，让本研究更迫切去研究GDF11是否与骨量丢失有关。

本研究用qPCR法发现GDF11的表达在BMSC+成骨分化液组显著下降，说明GDF11抑制成骨分化。qPCR法分析检测miR-92b-3p在BMSCs诱导分化为OB的表达：过表达miR-92b-3p后BMSCs成骨能力显著增强；过表达模拟物转染后miR-92b-3p水平上升，证明miR-92b-3p促进成骨，参与OP的形成。

本研究合成了GDF11野生型和突变型序列。导入miR-92b-3p模拟物可与GDF11野生型结合，说明GDF11是miR-92b-3p的靶基因。成骨诱导第7天，Runx2表达：BMSC+成骨分化液组显著上升，BMSC+过表达miR-92b-3p组显著上升；GDF11的表达：BMSC+成骨分化液组显著降低，BMSC+过表达miR-92b-3p组显著降低。故进一步推论GDF11为miR-92b-3p的结合靶点。

本实验不足之处如下，没有进一步行Western blotting检测miR-92b-3p的分化。本研究证实miR-92b-3p可通过GDF11因子作为靶点调节BMSCs分化参与OP的形成过程。为OP患者治疗及研究提供了一定的依据。