阿奇霉素辅助Ⅲ/Ⅳ期牙周炎患者非手术治疗的临床疗效及其对唾液微生物群落的影响

杨若渠，霍芃呈，胡琮佼，施明妍，罗礼君

牙周炎是一种以牙龈炎症、牙周支持组织破坏为特征的慢性炎症性疾病，其中重度牙周炎在全球范围内患病率约为11.2%[1]，波及数亿人口。Ⅲ/Ⅳ期牙周炎患者存在更多的牙齿缺失甚至牙列缺失的可能[2]。除了清除牙周致病微生物，控制其在牙周袋和口腔其他部位定植引起的再感染也非常重要[3]。因此，欧洲牙周病学联合会EFP和美国牙周病学会AAP联合建议，辅助应用抗生素可能有助于消除或抑制病原微生物，改善机械治疗的临床疗效[4]。

本研究旨在通过全身应用阿奇霉素(azithromycin，AZI)辅助Ⅲ/Ⅳ期牙周炎患者非手术治疗，通过临床检查和16S rRNA的高通量测序，比较常规龈下刮治及根面平整(scaling and root planing，SRP)和SRP联合AZI的临床疗效及治疗对唾液微生物群落的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料和分组

本研究获得同济大学附属口腔医院伦理委员会批准(批准号：2017-WJW-5)。样本量计算(R语言3.4.3，http://www.r-project.org)表明：根据以往文献，AZI组较SRP组探诊深度(probing depth，PD)改善按1 mm计算，则每个治疗组中需要的病例数需达到22例左右(90%置信区间，P<0.01)。考虑到患者失访等情况，每组纳入27例患者。选择2019年9月至2020年8月在同济大学附属口腔医院牙周科就诊的牙周炎患者54例(最终完成研究方案者40例)。由SPSS 27.0软件(IBM，Armonk，NY，美国)生成随机列表，将所有患者随机分配至AZI辅助非手术治疗组(AZI组)和常规非手术治疗组(SRP组)(图1)。

图1 研究流程图

1.2 纳入和排除标准

根据2018年AAP和EFP提出的标准进行牙周炎诊断[5]。纳入标准如下：①年龄18～65岁；②口内牙齿数目至少20颗；③最大邻面临床附着丧失(clinical attachment loss，CAL)≥5 mm；④影像学骨损失扩展到牙根的中三分之一及以上。排除标准如下：①有可能影响牙周状况的全身性疾病或其他状况；②有AZI过敏史或疑似过敏；③口内有正畸装置、延长或悬垂的修复体等；④妊娠期或哺乳期女性；⑤需要抗生素预防给药；⑥在研究开始前6个月内使用过抗生素、抗炎药；⑦定期使用化学制剂用于抗菌斑、抗龈炎治疗；⑧在研究开始前6个月内接受过牙周治疗；⑨不愿意参加随访。

1.3 实验设计

基线临床检查后，SRP组和AZI组患者均行全口SRP。AZI组患者在临床治疗后当天开始服用AZI，500 mg/d，连续3 d。在基线、SRP后第3天和第6周记录患者的牙周临床指标，收集唾液样本。

1.4 临床评估

在基线、牙周治疗后第3天和第6周进行临床评估，使用Florida探针对口内所有牙齿(第三磨牙除外)的6个牙周位点进行PD和CAL测量，记录探诊出血(bleeding on probing，BOP)情况。为减少技术差异，临床检查和治疗由两名经验丰富的牙周医生分别进行。检查者对实验不知情，检查者可重复性优(Kappa系数>0.85)。

1.5 唾液微生物群落多样性分析

1.5.1 样本DNA提取扩增 在基线、牙周治疗后第3天和第6周采集非刺激性唾液样本，储存于-20 ℃。使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences，美国)从唾液样本中提取微生物群落基因组DNA并通过琼脂糖凝胶电泳检测。用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)测定DNA浓度和纯度。通过ABI GeneAmp®9700 PCR热循环仪(Applied Biosystems，美国)，用引物对338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增细菌16S rRNA基因的高变区(V3-V4)。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃单延伸10 min，4 ℃终止，共27个循环。反应体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液(4 μL)、2.5 mmol/L dNTP(2 μL)、正向引物(5 μmol/L)、反向引物(5 μmol/L)、TransStart FastPfu DNA聚合酶(0.4 μL)、模板DNA(10 ng)和ddH2O(补足至20 μL)。PCR反应重复3次。PCR产物从2%琼脂糖凝胶中提取后，经AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒纯化，使用QuantusTM荧光计(Promega，美国)定量检测。

1.5.2 Illumina MiSeq测序 按上海美吉生物公司的标准，在Illumina MiSeq平台(Illumina，美国)上将纯化扩增子进行配对末端测序。

测序数据处理：将16S rRNA基因测序原始读段解复用，经Trimmomatic质量过滤后由FLASH合并。质控标准如下：①300 bp读段经50 bp滑动窗口质控，若平均质量评分<20则截断，去除短于50 bp的截断读段、字符模糊的读段；②组装重叠序列长于10 bp的序列，去除无法组装的序列，重叠区的最大错配率为0.2；③按barcode和引物区分样本，调整序列方向。使用UPARSE(版本7.1，http://drive5.com/uparse/)按97%的相似阈值将操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)归类，并去除嵌合序列[6]，应用RDP分类器(RDP classifier，http://rdp.cme.msu.edu/)按0.70的置信阈值与16S rRNA数据库比对(Silva SSU128)。

1.6 统计学分析

采用SPSS 27.0软件比较分析两组的临床参数。在各时间点计算每例受试者PD、CAL和BOP的均值和标准差，采用t检验、卡方检验、多因素重复测量方差分析检验组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床评价

共有40例受试者(AZI组、SRP组各20例)完成了研究流程，两组一般临床资料差异无统计学意义(表1)。

表1 患者特征及基线临床指标

与基线相比，两组治疗后PD和CAL均显著降低，其改善差异有统计学意义(P<0.001)。与SRP组相比，AZI组PD在治疗后第6周改善更显著(P<0.05)；在CAL改善方面，AZI组在治疗后第3天和第6周均较明显(P<0.05)(表2)。

表2 治疗前后牙周指标比较

研究对持续存在的牙周袋位点进行了分层计数统计，并根据PD和CAL的不同深度分为浅位点(<4 mm)、中位点(4～6 mm)和深位点(>6 mm)。位点水平分层结果显示：基线时，两组PD中、深位点数差异无统计学意义，SRP组CAL中位点数较少而深位点数较多(P<0.05)，两组其他各类位点及BOP阳性位点占比差异无统计学意义(P>0.05)。牙周治疗后第3天，AZI组PD、CAL改善比SRP组显著，BOP阴性位点占比均较高(P<0.05)。AZI组治疗后第3天PD的中、深位点更少，CAL浅位点占比高于SRP组，而深位点占比低于SRP组(P<0.05)。治疗后第6周时，AZI组PD、CAL和BOP阳性位点数与治疗后第3天相比均表现出改善趋势；且第6周时，与SRP组相比，AZI组PD、CAL浅位点和BOP阴性位点占比均较高，而CAL深位点和BOP阳性位点占比更低(P<0.05)(表3)。总体而言，治疗后AZI组的位点水平牙周指标优于SRP组。

表3 治疗前后位点水平牙周指标的比较

2.2 唾液微生物群落多样性分析

通过16S rRNA测序分析对两组唾液样品中的微生物群落进行表征，确定各分类单元丰富度、多样性和相对丰度。共检出26门、57纲、136目、225科、388属、669种以及1 179个OTU。样品中微生物群的结构和优势类群与以往的重度牙周炎研究报道大体相似[7-10]。

2.2.1 α多样性 通过α多样性评估样本微生物群落的物种丰富度和多样性。测序深度指数Good′s coverage为99.88%，表明样本中绝大多数的细菌被成功测序，大多数测序样本的稀释曲线接近渐近线，表明样本的测序数据量充足。与基线相比，AZI组治疗后第3天和第6周的Sobs指数、Ace指数(abundance-based coverage estimator)(代表微生物群落的丰富度)显著降低(P<0.01)，Shannon指数(代表群落多样性)明显降低(P<0.05)；治疗后第3天Shannon均匀度指数(Shannon evenness index，SEI)(代表群落均匀度)明显低于基线(P<0.05)。SRP组中仅Sobs指数在治疗后第3天明显降低(P<0.05)，无其他显著差异(图2)。

估计量的Wilcoxon秩和检验，*：P<0.05；**：P<0.01

2.2.2 β多样性 利用层次聚类(hierarchical clustering)确定样本在聚类分支中的距离，并根据不同的距离阈值将样本分为多个内聚组。主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)结果显示，SRP组和AZI组的细菌群落存在明显差异：在治疗后第3天和第6周，AZI组优势菌群远离基线区域的趋势较为明显，而SRP组优势菌群的变化并不明显。表明AZI治疗后，唾液微生物群落组成发生了明显改变(图3A)。非度量多维尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling，NMDS)的结果与此相似(图3B)。

A：OTU水平主坐标分析；B：OTU水平非度量多维尺度分析

2.2.3 菌群分型数据分析 根据目水平的细菌丰度计算Jensen-Shannon分歧度，使用PAM算法聚类，并绘制PCoA图。根据聚类结果，分析各组优势菌群结构，样本口腔菌群聚类为两种类型，按所占比例最高的菌目命名：一类为拟杆菌型，另一类为乳杆菌型。治疗后第3天和第6周，乳杆菌型所占比例两组均有增加，且AZI组更为明显(图4)。

A:目水平分型分析；B:分型分析柱状图

2.2.4 属水平物种组成比较 治疗后第3天，AZI组唾液样本中密螺旋体(Treponema)(P<0.001)、梭杆菌(Fusobacterium)和卟啉单胞菌(Porphyromonas)的占比明显降低(P<0.05)，而普雷沃菌(Prevotella)占比增加(P<0.05)；治疗后第6周，梭杆菌(P<0.05)和密螺旋体(P<0.001)构成比进一步降低，而此时，普雷沃菌构成比回落、卟啉单胞菌构成比有所上升，两者构成比均接近基线水平(图5B)。治疗前后SRP组菌群组成变化差异无统计学意义(图5A)。

A：SRP组各时间点物种组成构成比；B：AZI组各时间点物种组成构成比；*：P<0.05，**：P<0.01

3 讨 论

重度牙周炎可应用全身抗生素辅助治疗，如阿莫西林联合甲硝唑或者单独使用AZI。AZI是第二代大环内酯类抗生素，对牙周病原体有强效杀菌活性[11-12]，且不良反应发生率低，作用持久[13]，同时还有免疫调节作用[14]，可以缩短治疗时间，确保良好的患者依从性[15]。有研究显示，AZI联合基础治疗的疗效优于常规基础治疗，对深牙周袋位点炎症改善明显[16-18]。Nakajima等[19]认为基础治疗后连续3 d维持用量500 mg/d，对牙周疾病有效。有研究证明，在基础治疗后口服AZI 3 d的效果与口服阿莫西林或甲硝唑7 d的效果相同[20]。但也有学者认为，与SRP或SRP联合氯己定相比，AZI对牙周致病菌无明显影响[21-24]。因此，AZI辅助牙周非手术治疗的临床效果尚需进一步明确。

非手术治疗是牙周炎治疗的核心，现有的大量研究比较了各类抗生素辅助SRP治疗方案，以期减少牙周炎致病菌和相关组织损伤。本研究评估了常规SRP和SRP联合AZI两种治疗方案对Ⅲ/Ⅳ期牙周炎患者牙周非手术治疗的短期临床获益及对唾液微生物群落的影响。

在临床获益方面，本研究显示，治疗6周后，两组临床指标较基线均有明显改善。与SRP组相比，AZI组PD改善更显著。而在CAL及BOP改善方面，AZI组在治疗后第3天和第6周均较明显。AZI组深位点的PD、CAL改善较SRP组更明显，提示AZI对牙周袋深位点有效，这与Zhang等[18]和O′Rourke[25]Meta分析研究的结果一致，但Saleh等[26]的研究发现：无论是SRP联合AZI组，还是阿莫西林+甲硝唑(A+M)联合SRP组，与常规SRP组相比，对牙周深位点的治疗效果差异无统计学意义。这可能与不同研究的样本量大小、受试对象差异等多种因素有关。

口腔中有700多种细菌、真菌、病毒、古细菌和原生动物[27]，但只有少数病原菌可在一定条件下释放毒力因子干扰宿主防御机制，损伤牙周组织。正常情况下，口腔微生物菌落维持相对稳定的微环境。当平衡被破坏，机体则可能出现病变[28-29]。人类口腔微生物组数据库(the human oral microbiome database，HOMD)根据全长16S rRNA基因序列描述了750多个口腔分类群，可用于分析微生物群落结构的变化。

以往研究多采用龈下菌斑代表口腔微生物菌群，但龈下菌斑的采样要求较高，牙周治疗后的菌斑采集量有限，可能会影响数据分析的效度。研究表明，牙周病原体在龈下菌斑样本和唾液样本中的检出呈正相关[30]，两种样本的病原体检验效度相近[31]，而且唾液菌斑具有采集方便、重复性好等优点，因此本研究采用唾液采集方案，使用唾液菌群代表口腔微生物群落进行微生物学分析。

本研究对采集的唾液样本进行了微生物群落多样性分析，结果发现，AZI组微生物群落的丰富度、均匀度以及多样性在治疗后显著降低，而SRP组仅丰富度在治疗后第3天有所降低。菌群分型数据显示，治疗后第3天和第6周，乳杆菌所占比例两组均有增加，且AZI组更为明显。这表明AZI治疗后，唾液微生物群落组成发生了明显改变。属水平物种组成分析的结果表明，AZI对牙周红、橙致病复合体具有特异性作用。治疗后第3天和第6周观察到梭杆菌和密螺旋体的相对丰度持续减少；尽管治疗AZI组卟啉单胞菌在治疗后第3天相对丰度显著降低，但在治疗后第6周出现了一定程度的反弹。研究结果表明，与常规SRP相比，AZI作为靶向牙周红色和橙色致病复合体的辅助治疗可改善临床和微生物学参数。

本研究存在样本量较小、研究时间跨度较短等局限性，关于AZI辅助牙周非手术治疗的研究结论尚不明晰，需要更多多中心、大样本、更长时间的随机对照临床试验研究以进一步明确其临床疗效。

综上所述，AZI结合常规的牙周非手术治疗，能改善Ⅲ/Ⅳ期牙周炎患者的临床治疗效果，改变其唾液微生物菌群的组成，抑制其牙周红、橙复合体中的密螺旋体、梭杆菌和卟啉单胞菌。