唑来膦酸对大鼠颌面骨和外周骨创伤后骨改建的影响

龚 雪，钱文昊，苏俭生

双膦酸盐(bisphosphonates，BPs)具有较强的抑制骨吸收作用，是目前临床上应用最广泛的一线抗骨质疏松药物。它可通过延缓骨破坏，提高骨矿物质密度，增强骨骼强度以及降低骨折发生率，极大地提高患者的生活质量。然而近年来临床发现，长期应用BPs类药物可引起双膦酸盐相关性颌骨坏死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw，BRONJ)等严重不良反应[1-4]，引发国内外学者广泛关注。有流行病学资料显示[5-7]：接受静脉BPs类药物治疗的肿瘤患者，BRONJ的累计发病率为0.8%～12%；口服BPs类药物治疗的患者，BRONJ发病率较低，为0.01%～0.04%，但当加入拔牙等口腔侵入性治疗这一危险因素后，发病率呈现数量级的提升。BRONJ多发生于拔牙等口腔外科治疗后。60%～70%的BRONJ患者具有拔牙等创伤史，拔牙被认为是BRONJ发生的最重要的危险因素[8-9]，而伴有口腔炎性疾病在一定程度上又增加了罹患BRONJ的风险[10-12]。因此，口腔科医师在给服用BPs类药物的患者实施拔牙、牙周手术、牙植入、根尖手术等操作前需要仔细评估[13-14]。目前BRONJ无确切有效的临床治疗方法，仅限于保守治疗，且传统的治疗方法如大剂量抗生素、死骨清创术以及高压氧舱治疗等对其疗效并不理想[15-16]。上述治疗方法的问题和局限性使我们必须重新考虑治疗策略。因此，研究BPs导致的拔牙后颌骨坏死的致病机制和治疗方法，显得非常紧迫和必要。

BRONJ的致病机制迄今不明，多数学者认为拔牙等手术造成颌骨创伤后，BPs对破骨细胞产生的强大抑制作用导致颌骨骨改建受到过度抑制[17]。在正常骨组织中，成骨细胞和破骨细胞维持着一定的动态平衡，使得骨组织具有吸收重建功能。日常咀嚼等活动会对颌骨造成微创伤，但这种微创伤可通过骨内代谢完成自我修复。但BPs严重抑制了骨改建，从而导致拔牙窝周围骨组织重建失败，引发颌骨坏死。但这不能解释一个关键问题，为什么目前所报道的BRONJ多发生于颅颌面骨，未见发生于外周骨。从胚胎来源看，颅颌面骨起源于外胚间叶组织，主要为膜内成骨；外周骨起源于中胚层，骨发生形式为膜内成骨伴随软骨内成骨[18-19]。颅颌面骨和外周骨创伤重建过程中，破骨所需的细胞均来源于造血系统的单核巨噬细胞系，但成骨所需的细胞来源于各自局部组织内的骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。颅颌面骨和外周骨来源的BMSCs在增殖、诱导活性等方面具有不同的特性[20]。骨的重建由骨的生成和吸收构成，成骨细胞和破骨细胞的动态平衡是维持正常骨量的关键。

目前，关于BRONJ发病机制的研究主要集中在BPs对破骨细胞的作用，BPs作用下颅颌面骨和外周骨创伤修复能力差异不甚清楚。本实验从骨组织位点特异性角度出发，采用颌骨拔牙和胫骨制备骨创伤，观察第3代BPs代表药物唑来膦酸对大鼠颌骨与外周骨创伤后骨改建的影响，为探索BRONJ发病机制提供一个新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8～10周龄SPF级雌性Sprague-Dawley大鼠，体质量200～250 g，由上海市斯莱克实验动物中心提供。

1.2 试剂和仪器

唑来膦酸、蛋白酶抑制剂(Sigma，美国)；水合氯醛、利多卡因、多聚甲醛、EDTA、二甲苯、乙醇、石蜡(上海国药，中国)；苏木精-伊红染色试剂盒(南京建成，中国)；Masson染色试剂盒(凯基生物，中国)；大鼠RANKL ELISA试剂盒，大鼠OPG ELISA试剂盒(武汉中美，中国)；BCA蛋白检测试剂盒(康为生物，中国)；石蜡包埋机、石蜡切片机、石蜡展片机、石蜡烘片机、微电子计算机断层扫描(Leica，德国)；倒置相差显微镜(Nikon，日本)；移液器(Eppendorf，德国)；离心机、洗板机(Thermo，美国)；酶标仪(Tecan，瑞士)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠颌骨和外周骨创伤的建立 大鼠随机分为实验组和对照组，每组36只。实验组每周尾静脉注射唑来膦酸(80 μg/kg)，对照组注射等剂量磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)。用药两周后，在腹腔注射全身麻醉以及局部浸润麻醉下，牙龈分离器分离牙龈，微创拔除一侧上颌第一磨牙(图1A)，并用纱布压迫止血。同时在同侧胫骨近心端切开皮肤，钝性分离组织，暴露胫骨上端，在生理盐水冷却下于膝关节下约2～3 mm处用慢速手机制备骨缺损(图1A)，然后用纱布压迫止血后复位组织，缝合创口。术后肌注青霉素(500 000 U/kg)3 d以防止感染。之后继续用药，至术后1周、4周、12周，大鼠分批处死后，分离并收集颌骨和胫骨组织。

A：大鼠颌骨拔牙创；B：大鼠胫骨骨缺损；蓝色椭圆表示骨缺损部位

1.3.2 Micro-CT检测 分离和收集的骨组织样本进行Micro-CT检测，分析各组骨缺损区新骨形成情况。扫描参数设置为电压45 kV，电流550 μA，分辨率10 μm。扫描完成后，利用Dateviewer Pro和CTvol Software分析处理骨体积(bone volume，BV)、总体积(total volume，TV)和骨体积分数(BV/TV)数据。

1.3.3 组织学检测 收集的骨组织样本PBS冲洗干净后，在4 ℃下经4%多聚甲醛固定完全后冲水过夜，然后用10% EDTA在室温下脱钙，每3 d更换脱钙液至样本变软，以注射针头轻松刺入为准。冲水过夜后，用脱水机乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡，包埋机石蜡包埋后，以5 μm的厚度切片、展片、烘片，进行HE和Masson染色。

1.3.4 骨组织中RANKL、OPG测定 将原缺损区域的骨组织即刻放入液氮进行低温冷冻，待所有样本收集完毕后，用灭菌后的研钵对冷冻的骨组织进行充分研磨。用T-PER试剂进行组织裂解，离心后得到组织裂解液。按照ELISA试剂盒说明定量检测样本RANKL、OPG含量。考虑到不同骨组织样本中细胞数目不同对总的RANKL、OPG含量产生影响，我们检测了总蛋白含量来对其含量进行标准化处理。

1.4 统计学分析

以上所有定量数据以平均值±标准差形式呈现，使用SPSS 16.0软件包采用独立样本t检验分析组间差异，P<0.05表示具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Micro-CT扫描分析

Micro-CT三维重建后各组样本的矢状切面图如图2。拔牙后4周，实验组拔牙创表面高低不平，中央有浅碟状凹陷，可见游离的死骨片；对照组拔牙创可见新骨生成，已观察不到明显的缺损边界，但新骨形成表面较不平整。拔牙后12周，实验组拔牙创与4周时基本相似，表面仍高低不平，中部浅凹处有大量的游离死骨片，骨坏死呈现加剧趋势；对照组新骨形成区域与周边骨质均匀连接，骨改建已基本完成。术后4周，实验组胫骨骨缺损基本愈合，只是表面较不平整，骨皮质明显较对照组增厚，新骨生成亦较对照组活跃，松质骨内充盈着大量新生骨，形态规则，排列紧密；而对照组骨松质内的新生骨则较稀疏。术后12周，实验组胫骨缺损区骨皮质完整连续，较对照组厚且致密，骨改建已基本完成，骨松质内的新生骨亦明显较对照组排列紧密。

图2 术后大鼠颌骨和胫骨Micro-CT矢状切面图

各组样本术后BV/TV分析结果如表1。术后4周和12周，实验组胫骨BV/TV比值较对照组明显上升(P<0.05)，实验组颌骨BV/TV比值较对照组差异无统计学意义。

表1 骨体积分数BV/TV分析

2.2 组织学结果

组织学染色结果如图3～5。拔牙后4周，实验组拔牙创仍未愈合，创区黏膜溃烂，可见骨面暴露，死骨形成。在高倍镜下，病变骨质中骨细胞细胞核固缩或缺失，出现许多空的骨陷窝，而骨小梁排列紧密、增生明显，骨质出现不同程度的硬化，且周围伴有大量的炎性细胞浸润，为典型的BRONJ组织病理表现。对照组拔牙创已愈合，上皮组织已经完全覆盖创面。在高倍镜下，可见大量形态规则的骨小梁结构生成，开始了正常的生理性骨改建。拔牙后12周，实验组部分样本拔牙创表层虽有上皮组织覆盖，但在高倍镜下，骨坏死却呈现加剧趋势，空骨陷窝明显增多，死骨面积增大，坏死骨周围炎症浸润亦更为严重。对照组上皮组织完全覆盖创面，上皮下骨组织均匀连续，骨改建已基本完成。

B：骨组织；NB：坏死骨；IF：炎性细胞浸润；CT：结缔组织；E：上皮

术后4周，实验组胫骨骨缺损都已愈合，骨创处骨皮质外围有增生的纤维结缔组织包绕。实验组骨皮质明显较对照组增厚，可见较多散在呈红色的新骨生成(如图5红色箭头示)，新骨生成较对照组活跃。实验组松质骨内充盈着大量新生骨小梁，形态规则，排列紧密，而对照组骨松质内的骨小梁则较稀疏。术后12周，实验组胫骨缺损区骨皮质完整连续，较对照组厚且致密，骨改建已基本完成，而对照组中还可见少量红色新骨(如图5红色箭头示)，骨改建速度较慢。

B：骨组织；NB：坏死骨；IF：炎性细胞浸润；CT：结缔组织；红色箭头所示红色区域为新生骨

2.3 细胞因子检测

RANKL和OPG表达结果如表2。术后4周和12周，实验组颌骨和胫骨OPG表达均较各对照组轻度上升，但差异无统计学意义。术后4周和12周，实验组颌骨RANKL表达较对照组轻度下降，但差异无统计学意义。实验组胫骨RANKL表达较对照组上升(P<0.05)。术后4周和12周，实验组颌骨RANKL/OPG比值较对照组明显下降(P<0.05)，实验组胫骨RANKL/OPG比值较对照组明显上升(P<0.05)。

表2 RANKL、OPG表达和RANKL/OPG 含量比值

3 讨 论

唑来膦酸是第三代含氮杂环BPs，其咪唑侧链上含有2个氮原子，与骨组织中的羟基磷灰石亲和力高，可与骨组织牢固地结合，发挥抑制骨吸收作用，是目前临床上应用最为广泛、抗骨质吸收能力最强的BPs。本研究从骨组织位点特异性角度，应用第三代BPs代表药唑来膦酸对大鼠进行尾静脉注射，颌骨拔牙以及外周骨胫骨制备骨缺损，来研究唑来膦酸对大鼠颌骨和外周骨创伤后骨改建的影响。

本实验组织学染色显示，实验组拔牙创黏膜未愈合或延迟愈合，未愈合的黏膜下方可见骨面暴露、骨坏死，病变骨质中可见许多空的骨陷窝，而骨质出现不同程度的硬化，且周围伴有大量的炎性细胞浸润，为典型的BRONJ组织病理表现。对照组颌骨拔牙创4周内上皮组织已经完全覆盖创面，缺损区大量形态规则的骨小梁结构生成，进行了正常的生理性骨改建。实验组胫骨骨缺损在术后4周基本愈合，骨创处骨皮质厚且致密，松质骨内新生骨小梁密集，新骨生成活跃。而对照组骨皮质较薄，骨松质内骨小梁稀疏，新骨生成和骨改建速度较慢。可见，唑来膦酸对颌骨拔牙创伤后的骨改建起到明显的抑制作用，可以引起大鼠颌骨BRONJ样病变；而对外周骨胫骨骨创伤后的骨改建却起到一定的促进作用，可以较快地修复骨创伤，且未发生类似于颌骨骨坏死的现象。与目前文献报道的BPs引发骨组织坏死多发生于颌骨，未发生于外周骨的临床流行病学资料一致。

B：骨组织；NB：坏死骨；IF：炎性细胞浸润；CT：结缔组织

BPs引起的骨组织改变是全身性的，对骨组织影响广泛。病理结果显示，颌骨骨坏死均发生于拔牙窝附近，远端的骨质未涉及，且死骨周围多伴有大量的炎性细胞浸润，这一结果提示我们牙槽创伤是引发BRONJ的重要危险因素，而感染因素在BRONJ病程进展中亦起一定的作用。唑来膦酸对外周骨的作用，不仅对创伤处骨改建起一定促进作用，未发生类似颌骨坏死的现象，且还涉及非创伤处的远端骨质，骨皮质和骨松质都有一定程度的增生。

RANKL/RANK/OPG系统在调控骨吸收与骨生成动态平衡，保证正常的骨更新中起着重要作用[21]。RANKL主要位于成骨前体细胞表面，亦可表达于BMSCs等细胞的表面，可与破骨前体细胞和成熟破骨细胞表面表达的受体RANK结合，促进破骨前体细胞分化和成熟，并抑制破骨细胞凋亡，增强骨吸收。OPG表达于成骨前体细胞等的表面，可竞争性地与RANKL结合，阻断RANKL与破骨细胞表面RANK结合，抑制破骨前体细胞分化、成熟并诱导破骨细胞凋亡，从而抑制骨吸收。破骨细胞的数量和活性在RANKL/OPG比值上调时将增加，在比值下降时将降低。正常的骨重建和骨量的稳定依赖于RANKL和OPG的平衡。本实验中，实验组颌骨RANKL/OPG比值明显下降，而实验组胫骨RANKL/OPG比值明显上升。由此提示，唑来膦酸可通过调节成骨前体细胞表面RANKL/OPG等基因的表达来抑制破骨细胞的分化和功能，从而抑制创伤后骨表层破骨细胞的溶骨性活动。骨吸收和骨生成之间的平衡被破坏，致使拔牙窝周围骨重建过程受抑制，拔牙创经久不愈，引发颌骨坏死。而唑来膦酸对外周骨骨改建的影响恰好相反，RANKL/OPG比值上调，破骨细胞的溶骨性活动增强，在外周骨发生创伤后进行了活跃的骨改建，骨皮质较对照组厚且致密，骨松质新生骨小梁亦较对照组排列紧密。这可能是BRONJ常发生于颌骨而不是外周骨的重要原因之一。