铜稳态失调诱导调节性细胞死亡及其调控的研究进展

林锦贤， 王攀， 吴欣谋， 林育纯

(厦门大学公共卫生学院，分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室，福建 厦门 361102)

铜是人体的必需微量元素之一，是生物体中许多必需酶的辅助因子，具有较强的氧化还原活性和蛋白结合能力，经由细胞内铜稳态的维持和调控，参与细胞生理功能调节。环境外源因素暴露可导致细胞内铜代谢稳态失调，介导细胞毒性和机体损伤效应[1]。已知调节性细胞死亡(regulated cell death，RCD)的调控是决定细胞命运的关键[2]；过量铜暴露诱导的细胞毒性以及细胞死亡的机制尚未完全阐明。新近，Tsvetkov等[3]在Science的研究论文中证实，人类细胞中存在一种铜依赖的、受调节的细胞死亡，是依赖于线粒体呼吸但不同于已知细胞死亡(如细胞凋亡、坏死性凋亡、焦亡、铁死亡等)机制的新型RCD方式；并将这种新的铜依赖性细胞死亡方式命名为“铜死亡(cuprotosis)”。尽管铜死亡目前还没有在“细胞死亡命名”中得到确认[2,4]，但已有证据表明，铜诱导细胞死亡的机制不仅涉及细胞内铜的积累，也具有不同形式RCD的共性标志和特征，如诱导活性氧生成、抑制泛素-蛋白酶体系统等[1,5-6]。结合近年来本课题组开展有关外源物诱导不同形式RCD介导细胞毒性损伤及其相关信号通路调控机制的研究[7-8]，本文综述铜代谢参与介导外源物暴露诱导RCD及其调控机制研究进展，提出铜依赖性细胞死亡研究展望，为铜代谢功能失调相关毒性损害或疾病的干预和抗肿瘤潜在应用提供线索。

1 铜在机体细胞内转运、分布及其生理学作用概述

生物体中铜稳态依赖于不同形式铜离子的数量和分布等动态平衡调节。铜在生物体内以Cu+(亚铜离子，还原型)和Cu2+(铜离子，氧化型)两种不同的离子形式存在，参与细胞生理功能或病理过程的调控[1,9]。细胞外的Cu2+能够结合并调节生长因子与细胞膜受体的相互作用；细胞内则主要是保持Cu+状态，其中细胞膜上的Cu+可以直接或通过抑制磷酸酶发挥结构修饰和(或)氧化还原作用，改变生长因子的膜受体激活状态；细胞质中Cu+通过结构修饰或抑制磷酸酶，直接调节激酶活性；细胞核内Cu+通过结合转录因子，调节基因表达和随后的蛋白质合成[10]。

铜在生物体和细胞内的吸收、转运、储存和排泄过程，决定机体内铜的分布和稳态的调节。细胞外主要以Cu2+形式存在，其进入细胞前在细胞表面经金属还原酶(如STEAP家族)还原为Cu+才能被吸收。Cu+主要在肠道吸收，铜转运蛋白1(copper transporter 1, CTR1)以同源三聚体的形式存在于肠上皮细胞膜上，对Cu+的摄取具有高度特异性[11]。在血液循环中，铜与铜蓝蛋白(ceruloplasmin, CP)、白蛋白和跨铜蛋白等血浆蛋白结合，转运到器官和组织。已知外周组织和肝脏组织细胞中的铜转运ATP酶α(copper-transporting ATPase alpha, ATP7A)和β(ATP7B)，分别在细胞摄取铜和铜从肝细胞流出的过程中发挥转运作用[12]。ATP7A负责将铜转运到门静脉；肠道吸收的进入外周循环的Cu+通过门静脉循环到达肝脏，因此肝脏是铜的主要捕获者、分配者和排泄者，是调节全身铜稳态的核心。通过主动转运机制，细胞内铜浓度保持在非常低的水平，且主要以结合铜形式存在，以防止细胞内游离铜的积累及其对细胞的损害[13]。在细胞内，ATP7A将铜转运到反式高尔基网络和囊泡中，调节铜的亚细胞分布和靶向各种铜蛋白；例如肠上皮细胞或肝细胞内的Cu+，可以在铜伴侣蛋白作用下，参与合成铜锌超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)，是生物体中抗氧化酶体系的重要成员[1]。储存在肝细胞中的铜，可释放到血液中进一步分布，或运输到胆汁中排泄。其中，ATP7A可促进铜通过血脑屏障进入脑实质；ATP7B调控细胞内铜的排出，在铜过量时，肝细胞胞质中Cu+被铜伴侣蛋白抗氧化物1结合，通过结合ATP7B的N端金属结合域，转移至胆管膜处进入胆汁以排泄人体过量的铜[5,14]。

铜的储存和动员，在酵母中主要受定位于液泡的铜转运蛋白Ctr2和Ctr6调控。其中，Ctr2通过细胞膜铜伴侣蛋白促进铜的利用，Ctr2缺失可导致液泡中铜水平增加；Ctr6缺失可通过减少铜锌SOD1造成铜过载[1,9]。真核细胞中，线粒体是铜储存和动员的重要细胞器；位于细胞质和线粒体膜间隙的细胞色素C(cytochrome C, CytC)氧化酶铜伴侣蛋白17(COX17)可以结合1～4个Cu+，将细胞质中Cu+携带至线粒体间隙，并传递给细胞色素氧化酶缺陷同源物1，转移到细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase, CCO)Ⅱ和Ⅰ亚单位，以激活呼吸链中酶的活性。此外，细胞膜Cu+向线粒体间隙的转运目前尚不清楚，可能与从酵母和小鼠肝脏中分离出的一种结构不明的新型铜配体有关[1]。

铜稳态失调，如铜积累过多或运输不当，细胞内铜浓度超过稳态机制维持的阈值时，导致细胞产生毒性作用[15]。例如，严重的铜缺乏会导致多种损伤，包括由线粒体中的CCO功能障碍引起的能量产生受损；反之，细胞内铜过载也可诱导多种疾病的发生。研究表明，ATP7A基因突变引起铜吸收和利用功能丧失的门克斯病(Menkes disease, MD)，是一种发生在婴儿期、致命性的遗传性铜缺乏症，其特征是进行性神经损伤导致的死亡；ATP7B基因突变会导致肝脏和神经元铜超载诱发威尔逊氏病(Wilson′s disease, WD)等[12,16]。在细胞中，Cu2+积累的毒性作用和诱导细胞死亡，部分归因于与蛋白质位点的不当结合，导致蛋白质的错误折叠、聚集和功能丧失。研究表明，人正常肺支气管上皮细胞暴露于Cu2+，RNA微阵列分析发现热休克反应基因激活、泛素相关基因以及自噬调节基因表达增高，表明Cu2+诱导蛋白酶体降解，经由自噬可从细胞质中去除并进一步降解错误折叠和聚集的蛋白质复合物[17]。另外，铜平衡的改变与阿尔茨海默病中淀粉样斑块沉积和帕金森病中α-突触核蛋白的蛋白聚集有关[18]。

因此，靶向干预铜在机体或细胞中的转运和分布过程，是当前铜代谢失调相关疾病的主要新药开发策略。伊利司莫(elesclomol, ES)是一种高度亲脂性的Cu2+结合分子，可以运载铜离子穿过细胞膜，有望用于MD和其他遗传性铜缺乏症相关疾病的干预和治疗。Guthrie等[19]发现在Atp7a缺陷小鼠中，ES与铜离子结合、分拣铜转运到线粒体和募集到铜酶上，可增加脑中的CCO水平、减轻小鼠中MD病理改变和死亡率，预防有害的神经退行性变化，提高重度MD模型中斑纹样变小鼠的存活率。

2 铜外源物暴露诱导RCD和调控作用机制

铜是多种含金属酶的辅因子以及生物结构成分的必需元素，其生物学效应呈U形(非线性)剂量效应关系[20]；因此，铜稳态与肿瘤、肝损伤及神经系统、消化系统等多种疾病的发生密切相关，在其中发挥双向调控作用[13]。本文分析并讨论铜暴露及其代谢稳态失调诱导的相关RCD及其调控机制，具体模式图见图1。

2.1 铜诱导细胞凋亡及其分子机制

细胞凋亡是一种真核细胞常见的程序性细胞死亡或RCD形式。当细胞自身内部环境发生扰动，如DNA复制错误或损伤、内质网应激、活性氧超载等，或响应外部环境刺激影响(通常由死亡受体或依赖性受体家族激活)时，可引发相应的内源性或外源性细胞凋亡的发生，从而实现细胞生理功能的调节，或引起各种损伤和疾病相关的病理过程的调节[2,4]。本课题组前期报道了不同外源物暴露诱导细胞凋亡及其分子机制，例如，合成的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIO-NP)可诱导肝癌细胞凋亡且敏感性高于正常肝细胞，证实靶向线粒体电子传递链是介导癌症特异性细胞毒性的新分子靶点[7]；进一步发现SPIO-NP可诱导环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)表达及其转位在线粒体关联性内质网膜的分布，调节内质网-线粒体间通讯串话，介导线粒体依赖性凋亡和诱导肝细胞毒性[21]；乙型肝炎病毒X蛋白靶向诱导内质网应激，调节蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)的B56γ亚基，诱导细胞周期停滞和肝细胞凋亡[22]。已有研究在不同动物和组织中确认，铜能够引发细胞凋亡，较为普遍地将其归因于内源性凋亡类的线粒体和内质网等细胞器相关的应激损伤，证明调控这些细胞器应激损伤过程能够干预铜诱导凋亡和影响转归[13,17]。

图中缩略词按从左往右、从上往下顺序依次排列：ATP7A，铜转运ATP酶α；ATP7B，铜转运ATP酶β；CytC，细胞色素C；ROS：活性氧；Bcl-2，B淋巴细胞瘤-2蛋白；Bax，B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白；Bak，B淋巴细胞瘤-2同源拮抗蛋白；Caspase-9、-7、-3，半胱天冬酶-9、-7、-3；PERK，蛋白激酶R样内质网激酶；ERO1α，内质网氧化还原酶1α；ATF4、6，激活转录因子4、6；IRE1α，需肌醇酶1α；XBP1，X-Box结合蛋白1；ER，内质网；CTR1，铜转运蛋白1；ES，伊利司莫；DSF，双硫仑；p53，抑癌蛋白p53；γH2AX，磷酸化组蛋白H2AX；RIPK1、3，受体相互作用蛋白激酶1、3；p-MLKL，磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白；HIF1α，缺氧诱导因子1α；COMMD10，铜代谢MURR1结构域10；GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶4；LPO：脂质过氧化；Cu-NPs，铜基纳米颗粒；Fenton/Haber Weiss，芬顿反应和哈伯-韦斯反应；CTSB，组织蛋白酶B；NLRP3，NOD样受体家族成员3；ILs，白介素家族；GSDMD，穿孔素D；STEAP，六跨膜前列腺上皮抗原；DLAT，二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶；FDX1，铁氧还蛋白1；LA，硫辛酸；COX17，细胞色素C氧化酶铜伴侣17；HSP70，热休克蛋白70；TCA，三羧酸循环

铜经由内质网未折叠蛋白反应、内质网应激和氧化应激诱导细胞凋亡。Wu等[23]发现CuSO4处理的ICR小鼠肝脏细胞中CHOP通路、JNK通路和Caspase-12通路分子的mRNA和蛋白水平升高，激活相应通路增加肝细胞凋亡，产生颗粒状和空泡状变性损伤。Liu等[24]在CuSO4处理ICR小鼠中进一步验证了高剂量Cu2+暴露通过增加活性氧和蛋白质羰基化合物水平，降低谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量以及SOD等mRNA和酶活性诱导氧化应激，导致线粒体膜电位去极化，CytC释放、切割的Caspase-9和Caspase-3、Bak和Bax水平增加，Bcl-2降低，诱导细胞凋亡。此外，Zhao等[25]用铜纳米颗粒(copper nanoparticles, CuNPs)和CuSO4处理斑马鱼胚胎，发现视网膜的细胞内线粒体内膜减少并形成大的囊泡，部分内质网形成松散结构，诱导细胞中活性氧和非折叠蛋白反应相关的内质网应激，Caspase-3增加、Bcl-2蛋白下调，促进眼部细胞凋亡发生，导致视网膜发育缺陷；而清除活性氧、缓解内质网应激，可有效恢复铜应激相关细胞凋亡所致的胚胎视网膜缺陷；其中铜负载诱导的内质网应激与含CuNPs暴露和铜离子释放密切相关，给予CuNPs或Cu2+处理的铜转运蛋白Cox17-/-和Atp7a-/-突变体中，氧化还原相关和抗氧化基因、未折叠蛋白反应传感器基因均明显下调。

铜经由自噬和线粒体自噬通路诱导细胞凋亡。Luo等[26]给予小鼠单核巨噬细胞CuSO4处理，发现细胞中线粒体活性氧水平增高，经由蛋白激酶B-AMP活化蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的信号通路激活，诱导自噬发生和自噬体形成，切割的Caspase-3、-8、-9和聚(ADP-核糖)聚合酶蛋白表达增高，诱导细胞凋亡；采用线粒体活性氧抑制剂Mito-TEMPO和通过雷帕霉素干预自噬，可改善CuSO4诱导的细胞凋亡；敲低自噬相关蛋白5(autophagy related 5, Atg5)抑制自噬，可增强CuSO4诱导的细胞凋亡。Tang团队的系列研究中，Yang等[27]给予肉鸡喂食过量铜，发现鸡肝细胞出现不同程度的核膜破坏、染色质浓缩碎裂以及线粒体肿胀和空泡化，TUNEL阳性细胞数量增加，Bax、Bak1、Caspase-3、CytC等mRNA水平增高，Bcl-2下调，Pink1、p53基因上调，提示铜诱导线粒体损伤相关的细胞凋亡；通过PINK1/Parkin途径引发线粒体自噬可减弱凋亡损伤；采用3-甲基腺嘌呤抑制自噬可加重铜诱导的细胞周期S期停滞和凋亡率增加。

靶向铜诱导凋亡相关途径的功能药物开发和抗癌应用已有报道。研究发现，包括乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、甲状腺癌、口腔癌和胰腺癌等多种癌症患者血清和肿瘤组织中铜含量升高，并与部分癌症分期和进展密切相关[5-6,13]。癌症组织中的铜富集特征正在成为抗癌药物开发中有吸引力的靶点；基于靶向铜诱导凋亡有两种主要策略在临床前和临床条件下进行试验。第一种涉及使用铜螯合剂，如D-青霉胺、四硫代钼酸盐(tetrathiomolybdate, TTM)和曲恩汀等，通过直接与铜结合来降低铜的生物利用度；第二种是使用铜离子载体，如双硫仑(disulfiram, DSF)、二十二碳六烯酸和硫代氨基脲等，可以增加细胞内铜离子水平，通过产生活性氧、抑制蛋白酶体和诱导凋亡，发挥抗肿瘤作用[5,28-29]。其中，ES可螯合细胞外铜，以ES-Cu2+复合物形式进入细胞并可快速且选择性地转运至线粒体，使Cu2+被还原为Cu+，导致大量活性氧产生，触发癌细胞凋亡，对多种癌细胞发挥抗肿瘤活性[28]；例如，ES可诱导人T淋巴细胞白血病HSB2细胞中出现氧化应激反应特征性基因转录谱的变化，提示ES通过将活性氧水平提高至超过触发细胞死亡的阈值这一独特特征诱导癌细胞凋亡。DSF在抗癌应用中的巨大潜力引起关注。首先，癌细胞中含有通过CTR1跨膜转运的大量Cu+可与DSF反应，生成二乙基二硫代氨基甲酸铜配合物[Cu(DDC)2CuET]，特异性地靶向和渗透到癌细胞中，而不是铜水平低的正常健康细胞。其次，DSF在癌细胞中抑制SOD，并与GSH还原酶竞争，阻断由醛脱氢酶同工酶介导的活性氧清除和解毒，介导随后的氧化应激和DNA损伤，通过丝裂原活化蛋白激酶诱导线粒体通透性改变和凋亡[29]。第三，已经证实，DSF或代谢物与铜的结合物是许多癌症中功能性蛋白酶体相关蛋白的抑制剂，介导多泛素化蛋白和重要蛋白质(如IκB、p27和c-Myc等)的细胞毒性蛋白聚集体的积累，导致细胞周期阻滞和随后的凋亡[30]。第四，DSF-Cu复合物可抑制NF-κB活性，抑制肝癌中的上皮-间质转化，诱导细胞凋亡或使癌细胞对抗癌药物敏感等[31]。此外，研究者通过优化药物组装和递送策略等方法，改善DSF的稳定性差、代谢快速、血浆半衰期短等不足，以期发挥其靶向铜代谢调控的优越性介导抗癌效应[32]。

2.2 铜诱导细胞坏死性凋亡及其分子机制

坏死性凋亡是一种在形态上与坏死类似的RCD形式，特征包括质膜完整性丧失、胞质半透明化、细胞体积增加和细胞器肿胀；在机制上与细胞凋亡相似，坏死性凋亡主要由受体相互作用蛋白(receptor-interacting protein, RIP)激酶1(RIPK1)、RIPK3和混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like, MLKL)形成的坏死小体复合物介导和作为信号调控枢纽起决定性作用[2,4]。RIPK1/RIPK3/MLKL复合物通过引发线粒体功能障碍来诱导坏死性凋亡，涉及诱导线粒体自噬、线粒体活性氧产生、线粒体磷酸酶磷酸甘油酸变位酶家族成员5的激活，或诱导线粒体通透性改变等多种机制[33]。新近，厦门大学韩家淮院士团队Chen等[34]借助单分子定位超分辨成像技术，采用“随机光学重建显微镜”，在细胞原位首次观察到坏死小体在细胞中的组织结构特征，揭示了RIPK1/RIPK3信号中枢组成的分布及其与MLKL四聚体结合的精准信号，解析了坏死小体形成及其靶向细胞膜和决定细胞坏死性凋亡的分子调控机制。研究表明，多种外源物如金属化合物、纳米材料和病原微生物等的暴露，都可诱导细胞发生坏死性凋亡及其可被靶向调控和干预[35]。本课题组关注于外源物暴露诱导的坏死性凋亡发生及其线粒体质量控制调控相关机制研究[36]；乙肝病毒X蛋白与黄曲霉毒素B1联合暴露，通过COX-2介导坏死小体形成和线粒体动力学紊乱，触发肝脂肪变性[37]；镉化合物(Cd2+)诱导肝细胞毒性中，经由线粒体动力相关蛋白1和Rb蛋白互作，介导RIPK1/RIPK3/p-MLKL在线粒体的分布及其诱导的线粒体依赖性坏死性凋亡[38]；进一步发现在Cd2+诱导神经毒性中，线粒体氧化还原驱动的线粒体融合蛋白2的S-谷胱甘肽化修饰，通过破坏内质网-线粒体串扰，促进神经元坏死性凋亡[39]。

铜经由活性氧依赖性DNA损伤诱导坏死性凋亡和毒性损伤。铜离子是细胞核中最丰富的金属离子，细胞经CuCl2处理，Cu2+可进入核内结合DNA并引起其断裂。在鳟鱼原代肝细胞中，Cu2+和Cd2+都具有细胞毒性，引起细胞发生线粒体膜通透性改变、DNA损伤和细胞器肿胀，导致细胞坏死性凋亡；采用坏死性凋亡抑制剂Nec-1或z-VAD-FMK可缓解Cu2+引起的细胞凋亡；但是，相比于Cd2+的细胞毒性，Cu2+的毒性需要更高的浓度和更长的作用时间才能达到类似Cd2+的毒性水平[40]。

利用铜离子及铜化合物诱导细胞坏死性凋亡的调节作用，可应用于肿瘤化学预防和靶向干预。已知植物化合物如多酚等作用于血液分离的淋巴细胞，在Cu2+还原为Cu+及其再氧化过程中产生活性氧(尤其是羟基自由基)，结合染色质(尤其是鸟嘌呤)并导致DNA断裂；Nanni等[41]发现，采用牛至叶水醇提取物处理人黑色素瘤细胞，可以激活线粒体氧化应激产生活性氧并引起DNA断裂，使用铜螯合剂证实了Cu2+在DNA损伤中的作用；因此，利用化合物对铜浓度较高的肿瘤细胞具有选择性细胞毒性的特征(对非肿瘤细胞没有)，可诱导细胞坏死性凋亡的发生和介导肿瘤化学预防。此外，利用铜化合物组装的铜基纳米材料在诱导肿瘤细胞坏死性凋亡中被广泛应用，如用于磁共振成像的CuS-MnS2纳米花，诱导卵巢癌细胞的坏死性凋亡，可介导卵巢癌的光热/光动力治疗[42]。应用于临床成像诊断和具有光热/光动力疗法特性的CuS-NiS2纳米材料联合近红外光治疗，可诱导人胃癌细胞中产生活性氧，激活RIPK1/RIPK3/MLKL坏死小体复合物；干预MLKL会降低帽肌动蛋白(capping actin protein, CAPG)含量，证实通过MLKL/CAPG诱导坏死性凋亡的发生，可显著减小小鼠体内肿瘤体积[43]。采用铜介导的18F-标记设计的正电子发射断层扫描放射性示踪剂CNY-07，发现可以通过血脑屏障靶向RIPK1以表征脑中坏死性凋亡的发生并进行体内成像；联合RIPK1抑制剂如Nec-1和DL747等的使用，在治疗一些脑部疾病中具有更佳效果；提示铜相关坏死性凋亡作为生物标志，在疾病诊断、药物评估和分子机制研究方面具有潜在的应用前景[44]。

2.3 铜诱导细胞焦亡及其分子机制

焦亡是一种由炎性小体引发的溶解性程序性死亡，可清除受损细胞，同时引发炎症反应。不同因素诱导的细胞焦亡中存在相应炎性小体的典型激活，如损伤或病原相关分子模式诱导含有pyrin结构域的NOD样受体家族成员3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3)、细菌感染诱导含有CARD的NLR家族蛋白4 (NLR-family CARD-containing protein 4, NLRC4)、异常双链DNA诱导黑色素瘤中缺失的PYHIN家族成员2 (PYHIN family member absent in melanoma 2, AIM2)等激活，可活化Caspase-1，剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，经由穿孔素D的N端在细胞膜上形成的膜孔释放成熟白介素，如IL-1β和IL-18[2,4,45]。本课题组研究发现，黄曲霉毒素B1通过PP2A-B56γ靶向COX-2去磷酸化介导COX-2在线粒体关联性内质网膜分布及其内质网关联性降解，增强NLRP3依赖性肝细胞焦亡，并通过IL-1β释放、介导Kupffer细胞活化，促进肝脏炎症损伤[46]。

铜暴露诱导NLRP3依赖性细胞焦亡介导炎症反应。Deigendesch等[47]研究表明，铜经由经典的NLRP3炎性小体激活通路介导巨噬细胞焦亡并参与炎症反应的调节。首先，采用铜螯合剂TTM预处理后，小鼠腹腔注射大肠埃希菌来源的脂多糖构建NLRP3活化依赖性急性炎症模型，发现血清Caspase-1依赖性细胞因子降低，而不依赖Caspase-1的细胞因子不受TTM预处理影响；血清中游离组蛋白- DNA复合物和高迁移率族蛋白1水平降低；提示生物体内铜的利用障碍和消耗，可特异性抑制Caspase-1依赖性炎性小体激活及其介导的全身性损伤。其次，在脂多糖引发野生型和NLRP3缺陷型小鼠骨髓源性巨噬细胞中，TTM以剂量依赖性方式显著降低Caspase-1 p20活化、IL-1β释放和细胞焦亡；回补试验中仅添加Cu2+可逐步恢复TTM的抑制作用，提示铜特异性地激活NLRP3和焦亡是TTM抑制炎症反应的分子机制；且在各炎性小体干预试验中，证实铜对巨噬细胞中NLRP3典型激活诱导焦亡的调控具有特异性。第三，TTM预处理SOD1缺陷型小鼠腹腔巨噬细胞，再给予NLRP3炎性小体激活剂，发现其IL-1β释放和细胞焦亡降低，凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)降低，提示铜耗竭特异性地阻断经典NLRP3激活介导的焦亡，是由于铜依赖性SOD1活性下调所致。第四，体外试验中给予TTM处理人骨髓细胞系细胞，发现单核细胞IL-1β分泌和焦亡对铜耗竭不敏感；而从非感染性腹腔积液患者分离的腹腔巨噬细胞，经脂多糖和尼日利亚菌素引发后给予TTM铜螯合，可降低IL-1β分泌，提示巨噬细胞中典型NLRP3活化是铜稳态介导的特有调控作用[47]。Tao等[48]采用氧化铜纳米颗粒(copper oxide nanoparticles, CuONPs)处理小鼠巨噬细胞，发现NLRP3、Caspase-1和IL-1β等蛋白和mRNA水平以及IL-1β释放增加；给予NLRP3siRNA和Z-YVAD-FMK可降低CuONPs诱导的Caspase-1 p20和IL-1β的表达；提示CuONPs可经由NF-κB通路促进巨噬细胞NLRP3依赖性焦亡发生。透射电镜显示CuONPs沉积在溶酶体中，溶酶体渗透性增高，促进组织蛋白酶B释放和活性发挥；将CuONPs加入人工溶酶体液中孵育发现，酸性条件下可释放大量Cu2+；并且H2O2使CuONPs和铜离子产生的羟基加合物的信号增强；提示铜离子通过Fenton反应或Haber-Weiss反应的价态跃迁引起氧化应激，经由多途径级联诱导NLRP3炎性小体的串联激活。TTM预处理可减少CuONPs处理诱导的活性氧生成和NLRP3激活，表明巨噬细胞NLRP3依赖性焦亡发生需要铜的参与，减少铜的可利用性能缓解CuONPs诱导巨噬细胞焦亡介导的免疫损伤[48]。Hufnagel等[49]在分化的巨噬细胞样THP-1细胞和人非小细胞肺癌A549细胞共培养的肺组织模拟体系中，给予CuONPs处理，基因表达谱(包括细胞毒性和转录毒性谱)分析，发现共培养体系的A549细胞中巨噬细胞衍生趋化因子CCL22和IL-1β基因上调、SOD2表达增高[49]。由此提示共培养模拟CuONPs的呼吸道暴露，可经由诱导氧化还原反应增强而引起肺部炎症；其潜在机制为肺上皮细胞暴露于CuONPs后释放趋化因子招募巨噬细胞参与炎症应答，而铜可诱导巨噬细胞NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡和促炎转录因子激活，通过放大反馈进一步增强了IL-1β为代表的炎症水平，表明铜与肺局部免疫功能调控相关。

铜暴露诱导Caspase-1依赖性细胞焦亡介导肝细胞毒性。肝细胞是铜损伤和毒性的主要靶细胞之一。Tang研究团队Liao等[50]采用肉鸡原代肝细胞给予CuSO4以及与N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine, NAC)联合培养，结果发现Cu2+诱导细胞焦亡相关基因mRNA水平和Caspase-1蛋白表达升高，培养上清液中Caspase-1、IL-1β和IL-18含量增加，细胞空泡化，细胞体积和密度减小；NAC可缓解Cu2+引起的上述mRNA、蛋白质的变化；证明过量的Cu2+通过在肝细胞中产生活性氧诱导细胞焦亡。采用Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK联合Cu2+处理，细胞形态更接近正常肝细胞，可减弱Cu2+诱导的乳酸脱氢酶、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶的活性增加，且增加线粒体膜电位并减少细胞凋亡；表明抑制Caspase-1依赖性细胞焦亡可减弱Cu2+诱导的细胞凋亡，缓解肝细胞毒性损伤和死亡，提示铜暴露诱导凋亡和焦亡之间的关联性和信号通路串话[50]。

铜暴露诱导NLRP3依赖性细胞焦亡介导神经系统毒性。Dong等[51]采用CuCl2与脂多糖联合处理非突变对照小鼠来源的原代小胶质细胞，发现NLRP3、切割的Caspase-1、ASC和IL-1β蛋白水平呈时间依赖性升高；提示CuCl2暴露引发小胶质细胞NLRP3活化介导的炎症和随后的神经毒性[51]。采用近交系的自然突变小鼠，即毒性牛奶(toxic milk, TX)小鼠作为一种WD动物模型，发现TX小鼠纹状体、海马、皮层和小脑中Caspase-1、ASC和IL-1β水平升高；小鼠尾静脉注射慢病毒包封的siNlrp3干预，可下调TX小鼠脑部NLRP3蛋白水平，增加自发行进总距离和攀爬行为，改善小鼠运动功能；给予小鼠NLRP3抑制剂MCC950干预，可减轻纹状体、海马、皮层和小脑中铜沉积导致的神经元丢失及梗死，并显著增加TX小鼠自发行进的总距离，逆转其攀爬行为和运动功能的减少，改善其记忆力和空间学习能力，提示靶向干预小胶质细胞NLRP3焦亡介导的神经炎症可改善其行为学缺陷并对神经元具有保护作用，抑制NLRP3炎性小体激活可防止WD小鼠中铜过载诱导的神经病理学损伤。

铜暴露诱导内质网应激依赖性细胞焦亡介导空肠上皮细胞毒性。Tang研究团队Liao等[52]发现，高铜喂养会导致猪体重下降。采用CuCl2处理猪空肠上皮细胞，可引起细胞活性呈剂量依赖性下降、细胞破裂增多；Cu2+处理组内质网腔扩张明显，内质网应激和细胞焦亡标志相关mRNA和蛋白水平升高，葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)和Caspase-1荧光信号升高。采用内质网应激的抑制剂4-苯基丁酸和需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)抑制剂MKC-3946，可抑制内质网应激触发的IRE1α-X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)通路，缓解铜诱导的细胞焦亡。由此表明IRE1α-XBP1通路介导的内质网应激参与促进铜过量诱导的猪空肠上皮细胞焦亡；此为探讨铜化合物作为一种常见食品添加剂时，因摄入过量(铜暴露)引发肠道吸收的毒性作用和健康危害提供线索[52]。

2.4 铜诱导细胞铁死亡及其分子机制

“铁死亡(ferroptosis)”是一种铁离子依赖的，区别于细胞凋亡、坏死、自噬的程序性细胞死亡，以铁稳态的破坏和脂质活性氧的积累为主要特征；其形态特征变化主要表现为线粒体膜密度增加，线粒体嵴减少或消失，以及线粒体外膜破裂[2,4,53]。铁死亡可通过外源性或内源性途径诱发；外源性途径是通过抑制细胞膜转运蛋白，如胱氨酸/谷氨酸转运蛋白，或激活铁转运蛋白、转铁蛋白和乳转铁蛋白而启动；内源性途径是通过阻断细胞内抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)来激活[53]。研究表明，铁死亡受到多种细胞代谢事件的调节，包括氧化还原稳态、铁稳态、线粒体活性，氨基酸、脂质和糖代谢，以及与疾病相关的信号通路等；铁死亡调控和防御机制涉及细胞不同部位的抗氧化系统，如位于细胞质和线粒体的GPX4-GSH系统等[54]。因此，铁死亡作为一个调节细胞死亡的纽带，将代谢、氧化还原生物学和疾病联系起来。目前，铁死亡领域在许多方面方兴未艾；本课题组关注于铁死亡信号介导的抗肿瘤作用，及其与不同细胞器调控机制的关联性[55]。

铁死亡被认为是与铁相关的细胞死亡模式，但其他金属在此过程中的作用在很大程度上被忽略了[56]。Chen等[57]发现锌与铁相似，对铁死亡也起重要作用；锌螯合剂可有效拮抗Erastin诱导的人乳腺癌细胞和纤维肉瘤细胞铁死亡，补锌可逆转铁螯合剂保护的铁死亡；进一步发现促进细胞质锌水平的转运蛋白ZIP7对于铁死亡至关重要，这些对涉及铁死亡和锌失调的疾病具有治疗意义。类似地，锰也具有与铁类似的氧化还原活性；Mn2+通过二价金属转运蛋白转运，Mn3+通过转铁蛋白受体介导的内吞作用转运到细胞中。锰暴露在大脑中积累，尤其蓄积在线粒体中刺激H2O2产生，促进神经细胞发生凋亡；而采用铁螯合剂去铁胺联合处理，经由限制Fe2+转运和增加Mn2+吸收进而诱导更强的类芬顿反应，加剧细胞死亡[58]。特别的是，铜和铁之间存在代谢串话，可以是通过依赖铜的CP催化Fe2+氧化为Fe3+；或通过肠道中的铜-铁相互作用，由肠道表达的膜铁转运辅助蛋白介导，具有CP相似的Fe2+/Fe3+催化功能。过量Cu+/Cu2+和Fe2+/Fe3+通过芬顿反应影响细胞功能，催化反应性羟基自由基的产生，导致细胞脂质、核酸和蛋白质的永久性修饰，诱导严重的氧化损伤和细胞死亡[59]。目前，已有研究表明铜可以诱导铁死亡的发生，可能与不同含铜外源物和对不同细胞类型的作用有关。

铜诱导神经细胞铁死亡。Maher[60]在小鼠海马神经元HT22细胞的暴露模型中发现，FeCl2和CuCl2都诱导GSH消耗，可增强Erastin、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine, SSZ)和丁硫氨酸亚砜亚胺诱导的铁死亡和细胞活性下降；而且Cu2+增强SSZ和Erastin的毒性，如活性氧升高、GPx降低等，比Fe2+更有效；该结果为衰老相关神经退行性疾病的干预应用提供线索。Southon等[61]在大鼠原代神经元和永生化大鼠神经元N27细胞中，采用RSL3抑制GPX4活性或Erastin阻断胱氨酸摄取诱导铁死亡模型，发现二乙酰-双(4-甲基-3-氨基硫脲)CuⅡ[CuⅡ(atsm)]可抑制脂质过氧化和铁死亡；添加CuSO4无法挽救RSL3和Erastin诱导的细胞死亡，表明CuⅡ(atsm)可通过络合游离铜离子介导抗铁死亡作用；采用无金属配体H2(atsm)可阻止N27细胞的铁死亡，表明铁死亡可以通过铜离子来调节。

靶向细胞内铜离子诱导细胞铁死亡的调节作用，可应用于提高抗肿瘤作用敏感性。研究表明，铁死亡可以作为癌症脆弱性的靶点[54]；铜可通过氧化应激刺激铁死亡，提示根据结构和生物学特征设计新的铜配合物，可以使铜络合物(如ES)和铜螯合剂成为潜在的抗癌剂。其中，ES作为铜离子载体，可作为新的靶向药物发挥抗癌活性[28]。Gao等[56]采用ES处理结直肠癌细胞，可提高线粒体中的Cu2+水平、降低ATP7A的表达，导致Cu2+滞留和活性氧积累，促进SLC7A11降解，进一步增强细胞中的氧化应激并诱导铁死亡；表明ES通过降解ATP7A诱导结直肠癌细胞铜依赖性铁死亡，提示铜代谢在ES诱导癌细胞铁死亡中的重要性。研究表明，DSF可与抗肿瘤药物联合使用以增强抗肿瘤作用，在人类癌症治疗方面具有巨大的潜力[62]。Li等[63]采用鼻咽癌细胞系和非恶性鼻咽上皮细胞，给予DSF和Cu2+联合处理，发现细胞活力比单独DSF处理组明显受到抑制；RNA-seq分析转录组变化，发现铁死亡通路参与DSF/Cu诱导的细胞死亡，7个铁死亡相关基因发生显著变化，证实了DSF对鼻咽癌细胞的铜依赖性铁死亡诱导作用。Sun等[64]采用合成的FeCuS-脂质纳米粒子(AIBA@FeCuS-FeCO)，给予人胃癌细胞孵育和超声激活，或给予小鼠乳腺癌细胞荷瘤小鼠尾静脉注射后超声激活，发现该纳米粒子可被降解并释放出具有细胞毒性的AIBA自由基、CO、Fe2+和Cu2+，并通过CO介导的血管扩张增强肿瘤对AIBA@FeCuS-FeCO的吸收，促进细胞内Fe2+/Cu2+的积累，诱导羟基自由基和大量活性氧产生，以及线粒体膜电位降低，导致肿瘤细胞发生铁死亡；而使用DSF可进一步与释放的Cu2+螯合，产生有毒的双(N,N-二乙基二硫代氨基甲酸)Cu2+螯合物，协同增强消融深部原位肿瘤的治疗效果。

铜诱导细胞铁死亡的抗肿瘤协同增效作用及其信号通路调控机制已有报道。Ren等[65]研究发现，DSF/Cu可损害肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)细胞线粒体稳态，出现线粒体碎片化并聚集在细胞核周围；DSF/Cu和索拉非尼单一或联合处理组Huh7细胞中游离铁池、超氧化物和脂质过氧化物增多，激活p62S349的磷酸化；Huh7细胞皮下荷瘤模型裸鼠中，给予DSF口服和CuCl2肌内注射以及口服索拉非尼联合处理，证明DSF/Cu或索拉非尼可抑制肿瘤生长，提示铜联合抗癌药物诱导HCC细胞铁死亡发生具有协同增效作用。Yang等[66]研究显示，细胞内Cu2+增加有助于HCC细胞系的放射抗性；在HepG2细胞和小鼠辐射模型中，发现铜代谢MURR1结构域10(copper metabolism MURR1 domain 10, COMMD10)是辐射剂量依赖性降低的独特基因；COMMD10低表达诱导细胞内铜积累，抑制缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF1α)的泛素化和降解，诱导HIF1α表达和核转位，上调下游CP和SLC7A11靶基因，并促进细胞内GSH合成和降低脂质过氧化水平，协同抑制HCC细胞铁死亡；在共表达COMMD10/CP的HCC细胞中，可以恢复由COMMD10过表达引起的Fe2+和脂质过氧化的增加，促进HIF1α表达，形成正反馈回路；表明通过调节细胞内Cu-Fe稳态，抑制HIF1α/CP表达反馈环，可增强HCC细胞铁死亡和放射敏感性，为抑制HCC细胞的放射抗性提供新的靶点和干预策略[66]。因此，探明铜诱导细胞铁死亡的相关信号通路及其调控的分子机制，对探讨铜介导铁死亡等RCD参与毒性损伤作用和肿瘤化学预防具有重要意义。

3 铜依赖性细胞死亡(铜死亡)及其分子机制

新近，Tsvetkov等[3]研究显示，在人类细胞中铜离子的异常升高可能以一种不同于已知RCD机制的途径诱发细胞死亡；当阻断已知的细胞死亡方式，包括细胞凋亡、铁死亡、焦亡和坏死性凋亡时，铜离子仍然可以诱导细胞死亡。因此，将这种铜依赖的、受调节的细胞死亡方式命名为“铜死亡”[3]。

铜离子载体是结合铜离子的小分子，是研究铜死亡的重要工具[67]。Tsvetkov等[3]采用药物再利用数据库(该数据库采用分子条形码方法标记578个人类癌细胞系，通过混合物中相对抑制谱同步分析技术，测试了4 518种药物的抑癌活性)，通过分析1 448个载铜药物对489种癌细胞系的杀伤效果，结果发现载铜药物对所有的细胞系均有杀伤作用[3,68]。重要的是，以强效铜离子载体ES为受试物，发现ES诱导的人肾平滑肌瘤G402细胞死亡并不涉及Caspase-3切割或激活；而且敲除凋亡关键效应因子Bax和Bak，或者使用泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK和Boc-D-FMK，并不能逆转ES诱导的人非小细胞肺癌A549细胞和NCIH2030细胞等的死亡；表明铜诱导的细胞死亡与细胞凋亡不同。采用其他细胞死亡的抑制剂，包括ferrostatin-1(抑制铁死亡)、Nec-1和NAC等，都未能消除ES诱导的NCIH2030和A549细胞死亡；表明ES诱导的细胞死亡机制与已知细胞死亡不同[3]。

铜死亡的发生依赖于细胞内铜的积累。单独ES处理不影响恶性横纹肌瘤MON细胞的生长，但加入铜离子可使细胞生长受到抑制，而其他金属离子(如铁、钴、锌、镍等)并不能增强细胞的死亡。使用丁硫胺酸亚砜亚胺消耗细胞内GSH，可增加ES诱导的人肝癌JHH7细胞死亡；而铜螯合剂TTM联合ES处理人非小细胞肺癌ABC1细胞，其生长并不受ES影响；由此表明，ES诱导的细胞死亡是一种依赖于铜的可调节性细胞死亡[3]。

ES诱导的细胞铜死亡与线粒体呼吸密切相关。线粒体呼吸活跃的NCIH2030细胞(10 mmol/L葡萄糖培养基培养)对ES的敏感性是糖酵解活跃的细胞(10 mmol/L半乳糖培养基培养)近1 000倍。使用电子传递链复合物抑制剂(如鱼藤酮、抗霉素A)以及线粒体丙酮酸摄取抑制剂，可减轻ES诱导的ABC1细胞死亡；但是，线粒体解偶联剂对ES诱导的ABC1细胞死亡没有影响。缺氧条件培养也减弱了ES诱导的ABC1细胞死亡；由此表明，ES诱导的细胞铜死亡需要线粒体呼吸参与，以糖酵解方式产生ATP对铜诱导细胞死亡的影响较小。此外，ES处理没有降低ABC1细胞的基础或ATP相关耗氧率，但降低了呼吸备用能力；ES处理的ABC1细胞的代谢物组学分析显示，三羧酸循环相关代谢物，如柠檬酸盐、顺乌头酸、鸟苷二磷酸等，呈时间依赖性增加；由此表明，铜不直接靶向电子传递链，而是靶向干扰三羧酸循环[3]。

ES诱导铜死亡调控机制中的关键基因表达改变。给予人卵巢癌OVISE细胞ES和二乙基二硫代氨基甲酸酯处理，进行多重CRISPR-Cas9基因敲除筛选，确定了7个促进铜诱导细胞死亡的关键基因，包括铁氧化还原蛋白1(ferredoxin 1,FDX1)，以及硫辛酸途径中的脂酰转移酶1、硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,LIAS)、二氢硫辛酰胺脱氢酶、二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶(dihydrolipoamide S-acetyltransferase,DLAT)、丙酮酸脱氢酶E1-α1亚基和β亚基等基因，在ES暴露后均上调；上述基因的敲除均能抑制CuCl2和ES诱导的ABC1和OVISE细胞死亡[3]。

FDX1和蛋白质脂酰化是调控ES诱导铜依赖性细胞死亡的关键因子。蛋白质脂酰化是一种高度保守的赖氨酸翻译后修饰，通过将硫辛酸基团附着至底物蛋白质的赖氨酸残基，调节蛋白质功能。蛋白质脂酰化仅发生在二氢硫辛酰胺S-琥珀酰转移酶(dihydrolipoamide S-succinyltransferase, DLST)和DLAT等丙酮酸脱氢酶复合物的重要组成部分，这些酶的蛋白质脂酰化修饰是调节和发挥酶促功能所必需的[69]。乳腺癌和卵巢癌样本中FDX1与脂酰化蛋白表达高度相关；而且FDX1敲除的人胰腺癌PSN1细胞中脂酰化蛋白DLAT和DLST的表达完全丧失，并导致细胞耗氧率下降。此外，FDX1敲除的人慢性粒细胞白血病K562细胞的代谢物分析显示，硫辛酸代谢途径中丙酮酸和α-酮戊二酸出现积累，提示三羧酸循环的抑制。由此证实FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节因子，调控ES经由三羧酸循环诱导的细胞铜死亡[3]。

铜结合脂酰化修饰的三羧酸相关循环蛋白，调节其寡聚化和导致铁-硫(Fe-S)簇蛋白缺失，介导ES诱导的铜死亡。从ABC1细胞裂解物中纯化的DLAT和DLST蛋白能与铜直接结合，而敲除FDX1的ABC1细胞中提取的DLAT和DLST蛋白(由于脂酰化缺失)不再结合铜。铜与脂酰化的蛋白结合，导致DLAT脂酰化依赖性寡聚化；ES敏感细胞(ABC1细胞)给予ES处理，可增加DLAT寡聚体和不溶性DLAT的水平，可诱导细胞内明显DLAT“聚集斑点”；而ES不敏感细胞(A549细胞)或FDX1敲除和脂酰化缺陷ABC1细胞中，仅高浓度ES处理导致DLAT寡聚化；表明铜离子载体暴露可诱导脂酰化蛋白质异常寡聚化介导生物毒性。进一步分析显示，ES处理的ABC1细胞中Fe-S簇蛋白LIAS、乌头酸酶2、琥珀酸脱氢酶复合物铁硫亚基B、DNA聚合酶δ1催化亚基等呈FDX1依赖性的缺失，并诱导毒性应激蛋白中的热休克蛋白家族A(heat shock protein family A, HSP70)成员1B升高[3]。

Cu2+化合物诱导铜死亡及其信号通路调控已有报道。与ES诱导铜死亡作用一致，生理性的CuCl2补充也会导致A673细胞线粒体呼吸蛋白、脂酰化蛋白(DLAT，DLST)和Fe-S簇蛋白(FDX1等)表达降低，HSP70表达增高。FDX1和LIAS敲除均能逆转CuCl2诱导的ABC1细胞和人胚肾HEK293T细胞死亡；铜螯合剂消耗GSH可增加CuCl2诱导的细胞死亡。过表达铜吸收载体CTR1的HEK293T和ABC1细胞中，CuCl2诱导细胞死亡显著增加。而其他细胞死亡形式的抑制剂，不能逆转CuCl2诱导的细胞死亡[3]。

因此，铜死亡是通过铜与三羧酸循环的脂酰化成分直接结合而发生的，经由脂酰化蛋白质聚集和随后的Fe-S簇蛋白丢失，导致蛋白质毒性应激和最终的铜死亡[3]。同时也提示，铜离子载体诱导的铜死亡表型及其级联信号通路调节，在外源物诱导细胞内铜代谢稳态失调介导铜死亡等细胞命运结局中的作用，及其靶向干预和调控机制等仍有待进一步探索。

4 展望

综上所述，经由铜的吸收和转运介导铜代谢稳态的调节，维持细胞的生理功能；环境因素诱导的铜代谢稳态失调，可经由不同的RCD和新定义的铜死亡形式，介导细胞毒性损伤和肿瘤细胞死亡。因此，铜代谢稳态及其相关信号通路的调控机制有待深入研究。其中，本课题组关注于外源物诱导肝脏毒性损伤相关局部先天免疫反应及其线粒体调控机制，以及经由线粒体关联性多细胞器间的膜接触，如线粒体关联性内质网膜等，调节内质网-线粒体间通讯，诱导肝毒性和神经系统退行性损伤的分子机制[21,39]；提示局部细胞间代谢-免疫调节和细胞器间通讯串话在铜介导肝细胞和神经系统毒性中的作用值得关注。另外，本课题组还关注于PP2A不同B亚基靶向特定靶点蛋白去磷酸化、介导不同外源物诱导RCD依赖性细胞毒性和抗肿瘤作用的调控机制[22,70]。因此，铜暴露-效应与PP2A调控的关联性研究可为铜代谢稳态及其相关RCD和铜死亡提供新的分子机制。

目前，已有铜螯合剂和抑制铜吸收的药物，包括二巯丙醇、青霉胺、曲恩汀、锌盐和TTM等，在WD治疗中取得较好的效果[16]；ES和DSF等在凋亡抗性、诱导铁死亡等癌症敏感性中的作用，提示靶向铜转运系统可以提高肿瘤化学预防和抗癌药物的敏感性[28-29,56]；而且，利用脂酰化蛋白修饰在铜依赖性细胞死亡中的独特作用，探讨基于铜死亡的靶向干预具有潜在的应用前景[3,69]。因此，铜代谢稳态及其介导细胞死亡调节的信号通路，可成为铜代谢功能失调相关危害或疾病的潜在干预靶点，同时，可能提供一种新的抗肿瘤方法。

致谢

感谢厦门大学公共卫生学院吴佳燊、杜泽邦、钱波和林忠宁为本文提供的材料。