不孕不育或不良妊娠结局患者的9号染色体异态性类型▲

陈美佳 吕福通 黄 霈 赵 绮

(广西壮族自治区生殖医院检验科优生遗传实验室，南宁市 530021，电子邮箱：48174994@qq.com)

人类染色体检测中，经常可见到个别染色体上的微小变异，表现为同源染色体大小、形态或着色等方面的变异，这些变异区域一般位于遗传上不活跃的含高度重复DNA序列的异染色质区。9号染色体异染色质区的改变包括9号染色体臂间倒位和次缢痕的增加或减少，其中9号染色体臂间倒位的发生率约为1%[1]。9号染色体异态性携带者的外貌、智力与生长发育基本正常，但目前9号染色体异态性与生育结局的相关性争议较多。有学者认为9号染色体异态性属于正常变异，不会影响生育[1-2]；也有研究表明9号染色体异态性会产生不良的遗传效应[3-4]。本文探讨不孕不育或不良妊娠结局患者的9号染色体异态性类型及其与生育结局的关系，旨在为生育指导和遗传咨询、改善生育结局提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月至2020年12月在我院进行遗传咨询并行外周血染色体检测的8 030例不孕不育或不良妊娠结局的患者作为研究对象。其中男性6 860例，平均年龄36.5岁，女性1 170例，平均年龄31.0岁。不孕不育的诊断标准：已婚夫妇未采用避孕措施达1年以上仍未生育者。不良妊娠结局的定义：不明原因的自然流产、胚胎停止发育、死胎、死产、难产、胎儿畸形或胎儿发育不良等非正常妊娠结局。均由专科医生排除男女双方存在生殖器官的器质性病变，以及内分泌疾病、免疫和感染等因素。本研究经广西壮族自治区生殖医院医学伦理委员会批准(KY-LW-2020-1号)。向研究对象详细介绍本研究的具体内容、可能的受益和风险后，研究对象均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 外周血淋巴细胞培养基、秋水仙素(广东达辉生物技术有限公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)。Olympus CX21型显微镜(日本Olympus公司)、上海北昂医疗技术有限公司的医学图像分析识别系统(版本号：BEION V 4.20)。

1.3 研究方法 (1)采血与接种：常规消毒研究对象肘部的皮肤，抽取2 mL肘静脉血至肝素钠抗凝管中，将0.5 mL抗凝血接种至外周血淋巴细胞培养瓶进行培养。(2)外周血淋巴细胞培养：将培养瓶放置在37 ℃恒温培养箱中培养69～72 h。(3)细胞收集：培养完成前30 min加入2滴100 μg/mL的秋水仙素进行阻断分裂以收集中期细胞。将培养液放入离心管内，1 500 r/min离心10 min，弃上清液；加入5 mL 0.075 mol/L的氯化钾固定液，在37 ℃水浴中低渗30 min；使用2 mL甲醇：冰醋酸(3 ∶1)配置的固定液预固定5 min；1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入8 mL固定液后1 500 r/min离心10 min，弃上清液，再重复上述固定操作2次。(4)滴片：1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加1～2 mL固定液，混匀制成细胞悬液，将2～3滴细胞悬液分散滴在洗净的冰冻玻片上，自然晾干。(5)烤片：将玻片置于70 ℃～80 ℃烤箱内烤片2.5 h。(6)G显带消化与染色：烤片后第2天，在37 ℃水浴箱中用0.5%的胰蛋白酶消化，放入吉姆萨染液内染色，染色完成后取出玻片，自然晾干后即可镜检。(7)染色体核型分析：用染色体分析软件(上海北昂公司，版本：V4.20)进行染色体核型分析。每份标本在油镜下计数30个分裂相，分析10个染色体核型，对异常者加倍计数和核型分析，并按照《人类细胞基因组学国际命名体系》(ISCN2016)[5]的规定对结果进行描述，有高度重复DNA序列的区域为异染色质区，染色体异常检测结果均由2名遗传学专家进行分析与复核。

2 结 果

8 030例不孕不育或不良妊娠结局患者中，共检出9号染色体异态性携带者118例，占1.47%。其中9号染色体臂间倒位共97例，占全部患者的1.21%，占9号染色体异态性携带者的82.20%，核型均为inv(9)(p12;q13)；9号染色体次缢痕增加(核型为9qh+)20例，占9号染色体异态性携带者的16.95%；9号染色体次缢痕减少(核型为9qh-)1例，占9号染色体异态性携带者的0.85%。见表1。

表1 不同生育结局患者的9号染色体异态性类型

3 讨 论

染色体倒位是指一条染色体内同时发生两处断裂而形成的3个片段，翻转180°后重新连接形成一条重排染色体，倒位发生在长臂和短臂之间称为臂间倒位。臂间倒位以9号染色体最为常见[6]，9号染色体臂间倒位在国外人群中的发生率为0.95 %～1.02 %，在国内人群中的发生率约为1%[7-8]。本研究在8 030例不孕不育或不良妊娠结局的受检者中，检出9号染色体异态性携带者共118例，检出率为1.47%，其中9号染色体臂间倒位的检出率最高，为1.21%，较一般人群[7-8]略高。目前有关9号染色体臂间倒位区带的研究较多，Starke等[9]报告9号染色体臂间倒位断裂热点区域位于9p12或9q13-21.1，本研究检出的9号染色体臂间倒位断裂位点均发生在9p12与9q13之间，说明9号染色体的这段区域易发生断裂。有文献报告9号染色体pter到q12片段上存在松弛素基因，而松弛素可影响女性卵泡的成熟过程，也影响男性的精子运动和穿卵能力；9号染色体臂间倒位产生的位置效应可能会影响松弛素基因的表达，从而导致生殖障碍[7]，当臂间倒位发生在9q12远端时对生育的影响尤其明显[10]。本研究中有41例不孕不育患者、56例不良妊娠结局患者检出9号染色体臂间倒位，倒位均发生在9q12的远端区域，但未检测9号染色体臂间倒位携带者是否有松弛素基因表达异常，今后仍需进一步研究。

9号染色体臂间倒位与不孕不育、不良妊娠结局的关系一直有争议。有文献显示，9号染色体臂间倒位与生育结局异常没有直接关系，属于遗传学多态性[1-2]。但也有学者报告，9号染色体臂间倒位在不孕不育或不良妊娠结局人群中的检出率较高[3-4]，9号染色体臂间倒位可干扰减数分裂时同源染色体的配对或造成其他染色体的配对异常，从而引起临床效应[11]。9号染色体的倒位重排还可能导致部分基因的顺序发生改变，影响基因的正常表达，表现为胚胎发育异常或不孕不育[7]。然而，9号染色体的臂间倒位是否对生育结局有影响，笔者认为应该从发生臂间倒位的区带判断：若9号染色体臂间倒位发生在异染色质区内，如9q12的次缢痕区，由于该区域为高度重复的DNA序列，不编码主要遗传信息，因此该区域发生的臂间倒位不属于结构异常，理论上对患者的表型、智力、生长发育不会造成严重的影响。但如果9号染色体臂间倒位发生在异染色质区外，由于这种异常属于染色体的结构异常，这类倒位染色体在减数分裂时形成倒位环，正常的染色体和倒位的染色体之间发生交叉互换，导致配子染色体上某一片段缺失或重复，此时其遗传效应主要取决于重复或缺失片段的长短及其所含基因的致死效应，倒位片段越短，则重复或缺失片段就越长，其配子和合子正常发育的可能越小，临床表现为不孕不育、流产、死胎等症状[12]。

目前，在传统的细胞遗传学层面上，一般采用G显带技术结合C显带技术对9号染色体异态性进行分析，但该方法受细胞遗传水平的核型分辨率及操作者人为主观因素的影响，定位并不完全准确，难以明确区分9号染色体臂间倒位是否涉及异染色质区外。Starke等[9]发现9号染色体臂间倒位主要发生在9q13-21.1，国内也有学者报告9号染色体臂间倒位片段多定位于p11及q12远端[10]，这都表明了9号染色体臂间倒位发生在异染色质区外的情况不容忽视。采用G显带技术进行分析时，对于5M以下的变异难以用肉眼判别，因此也不能完全排除9号染色体发生臂间倒位的同时断裂位点周围是否存在基因突变或微小缺失和重复等情况，需要通过基因测序等分子检测技术进一步鉴定，以明确9号染色体不同位点的断裂及其与临床表现的相关性，从而更好地进行生育指导和遗传咨询。由此推断，目前众多文献报告的9号染色体臂间倒位所涉及的断裂点可能在异染色质区外，应考虑为结构异常或基因变异，这或可为9号染色体臂间倒位携带者表现出不同临床症状的结论提供合理的解释。

9号染色体次缢痕区为染色体长臂上凹陷缩窄的异染色质区，该区域为高度重复的非编码DNA序列，次缢痕部位的DNA松散，容易自发和诱发断裂，其增加或减少可导致次缢痕的增加或减少，从而干扰染色体的运动和分离，造成减数分裂过程中同源染色体配对困难或分离异常，进而影响配子的形成，导致不孕不育或自然流产等不良生育结局[12]。此外，有研究报告次缢痕区大量重复的DNA可能会导致在胚胎早期调控细胞分化的基因发生异常或剂量效应，从而造成有丝分裂错误，最终导致不孕不育、胚胎停育或自然流产等临床结局[13]。Minocherhomji等[14]研究发现，原发性不孕不育患者的9号染色体次缢痕增加检出率升高，提示9号染色体次缢痕增加与不孕不育有关；王桂玲等[15]报告复发性流产者9号染色体次缢痕增加的检出率明显升高，提示9号染色体异态性与复发性流产可能存在相关性。但也有学者认为9号染色体次缢痕的增加或减少属于正常的染色体变异，不会导致不孕不育或不良妊娠结局[16]。可见，对于9号染色体次缢痕增加或减少与生育结局的相关性，目前尚无统一定论，本研究中共检出9号染色体次缢痕增加20例，其中17例出现不良妊娠结局、3例临床表现为不孕不育；检出9号染色体次缢痕减少1例，为有不良妊娠结局的患者。但由于本研究缺乏对正常生育人群9号染色体次缢痕增加或减少发生率的研究，加之9号染色体次缢痕减少的患者样本量少，因此仅能得出次缢痕变化可能存在潜在临床效应的结论，今后仍需扩大样本进一步研究。

综上所述，不孕不育、不良妊娠结局患者中9号染色体异态性中臂间倒位的发生率较高，其对生育结局的影响取决于发生倒位的区带，不能一概而论归为正常的多态性变异。由于染色体核型分析技术的局限性，以及各实验室人员对断裂位点的判断不统一，9号染色体臂间倒位是否会引起不良的遗传效应，如造成不孕不育、自然流产、胚胎停育等，仍需要更多的实验数据验证，并结合细胞与分子技术手段进一步研究。9号染色体次缢痕增加或减少可能存在潜在的临床效应，也需进一步研究证实。若能进一步研究正常生育人群与9号染色体异态性携带者生殖细胞减数分裂和胚胎形成过程中染色体的变化情况，可为探讨9号染色体异态性对生育结局的影响提供更多的参考。