lncRNA GAS5调控miR-21抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化

王冠贤 李宝林 唐爱民 黄永湘

(儋州市人民医院骨科，海南 儋州 571700)

骨缺损是常见的临床问题，主要由创伤，生理性、病理性骨吸收导致〔1〕。在整形外科中，需要通过骨再生修复缺损提高患者的生活质量，而在一些骨疾病中，需要通过骨再生治疗恢复丢失的骨量〔2，3〕。人骨髓间充质干细胞(hBMSC)是具有多种分化潜能的细胞，主要向成骨细胞、脂肪细胞分化，对调控骨组织重建、代谢有重要作用〔4，5〕。微小RNA(miRNA)是一类由18～25个核苷酸组成的非编码小分子RNA，通过调控靶基因的表达，影响细胞的增殖、凋亡、分化等过程〔6〕。研究发现，miR-21在hBMSC的成骨分化调控中起重要作用〔7〕。长链非编码RNA(lncRNA)生长特异抑制物(GAS)5作为一种lncRNA，与miR-21存在互补区域，可以竞争性与miR-21结合形成沉默复合体，进而影响miR-21发挥作用〔8〕。但lncRNA GAS5在成骨分化方面尚缺乏研究。本研究旨在探讨lncRNA GAS5调控miR-21对hBMSC成骨分化的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 hBMSC细胞(批号：os101059)购自美国ATCC细胞库；α-MEM培养基(批号：MEP10-10LT)购自美国Caisson Labs公司；Lipofectamine 2000转染试剂(批号：11668019)购自美国Invitrogen公司；TRIzol试剂、逆转录试剂盒(批号：R0016、D7168S)购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒(批号：BB-3009、BB2108)购自上海贝博生物科技公司；实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒(批号：K1002S)购自美国Promega公司；成骨分化试剂盒(批号：A1007201)购自美国GIBCO公司；碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(批号：121862)购自北京凯瑞基生物科技有限公司；ALP活性测定试剂盒(批号：8258)购自美国Sciencell公司；Runt相关转录因子(RUNX)2抗体、骨形态发生蛋白(BMP)2抗体、骨唾液蛋白(BSP)抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(批号：ab76956、ab14933、ab52128、ab181602)购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(批号：0295G-HRP)购自美国Santa公司；negative control-GAS5、GAS5 mimic、nonsense siRNA、GAS5 siRNA序列及GAS5、miR-21、RUNX2、BMP2、BSP、ALP、U6、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；恒温培养箱(型号：MIR-162-PC/MIR-262-PC)购自日本松下公司；显微镜(型号：CX31)购自日本Olympus公司；酶标仪(型号：ChemiDocXRS)、化学发光成像系统(型号：MODEL550)购自美国Bio-Rad公司；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500)购自美国Applied Biosystems公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 含有10%胎牛血清的α-MEM培养基将hBMSC制成单细胞悬液，接种于多聚赖氨酸包被的T-75培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。次日更换培养基，此后每3天更换1次培养基。待细胞融合率达到85%左右时，用胰蛋白酶消化、传代培养。将对数期hBMSC以1×104个/孔接种于96孔培养板，分为：对照组、mimic NC组、GAS5 mimic组、siRNA NC组和GAS5 siRNA组，其中对照组hBMSC不进行转染，mimic NC组、GAS5 mimic组、siRNA NC组和GAS5 siRNA组hBMSC使用Lipofectamine 2000转染试剂分别转染negative control-GAS5、GAS5 mimic、nonsense siRNA、GAS5 siRNA。

1.2.2qRT-PCR检测各组hBMSC中lncRNA GAS5、miR-21及成骨相关因子mRNA表达情况 将转染处理后的hBMSC培养48 h，收集细胞，qRT-PCR检测lncRNA GAS5、miR-21表达水平，内参基因为U6、GAPDH；将转染处理后的hBMSC诱导成骨分化培养7 d，收集细胞，qRT-PCR检测RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA表达水平，内参基因为GAPDH。使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，反应程序：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，循环40次。引物lncRNA GAS5上游：5′-AAGCCATTGGCACAGGCATTAG-3′，下游：5′-AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA-3′；miR-21上游：5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′，下游：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；内参U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；内参GAPDH上游：5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游：5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′；RUNX2上游：5′-TTCACCTTGACCATAACCGTC-3′，下游：5′-GGCGGTCAGAGAACAAACTAG-3′；BMP2上游：5′-GGTATCACGCCTTTTACTGCC-3′，下游：5′-ACACCCACAACCCTCCACAA-3′；BSP上游：5′-CACTGGAGCCAATGCAGAAGA-3′，下游：5′-TGGTGGGGTTGTAGGTTCAAA-3′；ALP上游：5′-AGAATCTGGTGCAGGAATGG-3′，下游：5′-TCGTATTTCATGTCTCCAGGC-3′。相对表达量均以2-ΔΔCt法表示，Ct值为扩增产物的荧光信号达到临界阈值时对应的循环数。

1.2.3各组hBMSC ALP染色情况 经转染处理后，将hBMSC诱导成骨分化培养7 d，按ALP染色试剂盒说明书进行ALP染色。弃上清液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，4%多聚甲醛固定30 s，PBS洗涤，每孔加500 μl显色反应液，37℃避光孵育30 min，蒸馏水漂洗直至不再脱色，显微镜照相。

1.2.4各组hBMSC ALP活性检测 经转染处理后，将hBMSC诱导成骨分化培养7 d，PBS洗涤，加入30 μl/孔细胞裂解液振荡裂解30 min，加入50 μl/孔缓冲液及50 μl/孔基质液，混匀后37℃恒温水浴15 min，加入150 μl显色剂，在酶标仪520 nm波长处测定每孔的ALP活性。

1.2.5Western印迹检测各组hBMSC中成骨相关因子蛋白表达 经转染处理后，将hBMSC诱导成骨分化培养7 d，收集细胞，使用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度并进行定量。电泳分离等量蛋白质并转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，分别加入RUNX2抗体、BMP2抗体、BSP抗体、GAPDH抗体(均为1∶500)，4℃孵育过夜，TBST洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，免疫反应化学发光法显色，Tanon 600图像分析系统拍摄图像并分析条带灰度，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

1.3统计学分析 采用SPSS24.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组hBMSC中lncRNA GAS5、miR-21表达情况 对照组、mimic NC组、siRNA NC组间hBMSC中lncRNA GAS5、miR-21表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与mimic NC组相比，GAS5 mimic组hBMSC中lncRNA GAS5水平显著升高(P<0.05)，miR-21水平显著降低(P<0.05)；与siRNA NC相比，GAS5 siRNA组hBMSC中lncRNA GAS5水平显著降低(P<0.05)，miR-21水平显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组hBMSC中lncRNA GAS5、miR-21表达水平比较

2.2各组hBMSC中成骨相关因子mRNA表达情况 对照组、mimic NC组、siRNA NC组间hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与mimic NC组相比，GAS5 mimic组hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平显著降低(均P<0.05)；与siRNA NC相比，GAS5 siRNA组hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平显著升高(均P<0.05)。见表2。

2.3各组hBMSC中ALP染色情况 对照组、mimic NC组、siRNA NC组间hBMSC细胞ALP染色无明显差异；与mimic NC组相比，GAS5 mimic组hBMSC细胞ALP染色明显减弱；与siRNA NC组相比，GAS5 siRNA组hBMSC细胞ALP染色明显增强。见图1。

2.4各组hBMSC中ALP活性 对照组、mimic NC组、siRNA NC组间hBMSC中ALP活性差异无统计学意义(P>0.05)；与mimic NC组相比，GAS5 mimic组hBMSC中ALP活性显著降低(P<0.05)；与siRNA NC相比，GAS5 siRNA组hBMSC中ALP活性显著升高(P<0.05)。见表2。

2.5各组hBMSC中成骨相关因子蛋白表达情况 对照组、mimic NC组、siRNA NC组间hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与mimic NC组相比，GAS5 mimic组hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与siRNA NC相比，GAS5 siRNA组hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见表3、图2。

表2 各组hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平及ALP活性比较

图1 各组hBMSC中ALP染色

表3 各组hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表达水平比较

1～5：对照组、mimic NC组、GAS5 mimic组、siRNA NC组、GAS5 siRNA组图2 各组hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表达情况

3 讨 论

骨缺损是全球性的健康问题，与创伤及骨质疏松、骨折等多种骨疾病的发生有关。研究表明，骨主要包括促进骨形成的成骨细胞和促进骨吸收的破骨细胞，是一个连续的动态平衡组织，在正常的骨组织中，两种细胞处于平衡状态，一旦平衡打破，成骨细胞的骨生成低于破骨细胞的骨吸收，就会导致骨破坏疾病的发生〔9，10〕。骨再生是由成骨细胞、破骨细胞、其他多种细胞及细胞因子共同参与的复杂修复过程，是破骨细胞介导骨吸收及成骨细胞介导的骨形成的一个动态平衡过程。hBMSC是骨组织工程的重要种子细胞，具有自我克隆增殖及向成脂细胞、成骨细胞等分化的能力，临床常通过体外诱导使hBMSC分化成软骨、成骨细胞等，在多种疾病的治疗中发挥作用〔11〕。lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子，缺乏较明显的开放阅读框，具有较低甚至不具有翻译蛋白质的功能，通过介导表观遗传修饰、转录调控、转录后调控及其他的特定调控模式发挥作用〔12〕。研究发现，许多lncRNA与成骨细胞、破骨细胞相关，参与骨再生过程的调控，同时与骨关节炎的发生、发展有着密切的联系〔13,14〕。Li等〔15〕发现lncRNA GAS5的表达在骨关节炎软骨中上调，并且可能通过上调基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-13、BMP-2和ADAMTS5 mRNA表达水平促进骨关节炎的发生发展。Song等〔16〕发现lncRNA GAS5在骨关节炎软骨细胞中表达上调，可能通过增加几种MMPs的表达水平，影响软骨退化和骨关节炎进展。本研究结果提示GAS5可能影响成骨分化过程中ALP、RUNX2、BMP2、BSP等成骨分化标志基因的转录、翻译水平，在hBMSC成骨分化过程中起负向调节作用〔17〕。研究表明，miRNA在细胞凋亡、分化等生理病理过程中有重要作用。彭建强等〔18〕研究表明，miR-21可外调控MC3T3-E1细胞成骨分化，在骨形成过程发挥作用。宋琪玲等〔19〕研究表明，miR-21可以通过增强BMP9/Smad信号通路的激活程度，促进hBMSC C3H10T1/2细胞成骨分化过程。而郑伟等〔20〕研究发现，LncRNA-GAS5作为miR-21的“分子海绵”，通过“吸收”miR-21从而调控miR-21对靶基因的抑制。本研究结果提示在hBMSC中，GAS5可能通过调控miR-21，进而影响hBMSC细胞的成骨分化过程。

综上，lncRNA GAS5在hBMSC成骨分化过程中发挥负向调控作用，可能与抑制miR-21表达有关。lncRNA GAS5有望作为成骨分化的调控靶点，但将其应用在骨再生临床治疗中，还需进一步在体内进行验证。