LEA、CDw75 在大肠腺癌组织中的表达及其临床意义

沈 红 ，华海蓉 ，高丽萍 ，何易晓 ，杨学智 ，曾祥菲 ，王 芳 ，宋精玲

（1）昆明医科大学基础医学院病理学与病理生理学系，云南 昆明 650500;2）昭通市第一人民医院病理科，云南 昭通 657000;3）电子科技大学医学院，绵阳市中心医院病理科，四川 绵阳 621000;4）四川大学华西医院临床病理科，四川 成都 610000;5）昆明医科大学电镜室，云南 昆明 650500）

大肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是消化道最多见的恶性肿瘤之一[1]，近年来发病率呈总体上升态势。由于大部分癌前病变发展为结直肠癌需要较长的时间（约10 a），早期症状又不明显，故不易被发现，在明确诊断前大多数患者多被延误3～6 个月或更长，甚至被误诊为慢性肠炎、肛瘘等疾病，从而丧失最好的治疗时机。所以，大肠癌的预防、筛查、早期诊断及治疗显得非常重要。

结直肠癌是最合适选择筛查和预防的肿瘤，有效的筛查可以提高癌症的一级预防。已证实，大肠癌筛查能通过切除其癌前病变腺瘤性息肉来阻止疾病发生和发展，极大地降低患者的死亡率[2-3]。因此，找到一种对大肠癌灵敏度和特异度较高的分子生物学标记物，获得操作方便、成本低、效益好、临床实操性强的筛查方法，用于大肠癌的早期临床检测和人群普查，使腺瘤等癌前病变和早期大肠癌得以发现，而不至于耽误病情，降低大肠癌的发生率和患者死亡率就显得尤为重要。

大分子外部抗原（large external antigen，LEA）是一种膜表面肿瘤相关抗原，分子量 ＞ 500 KD[4]，其抗原决定簇位于抗原的糖链部分上，成分为唾液酸[5-6]，由细胞粗面内质网合成，并可排泌到细胞外，在大肠癌患者的血清和腹水中能够被检测到。分化抗原簇75（cluster of differentiation antigen 75，CDw75）是由β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸转移酶产生的糖缀合物唾液酸化的产物，部分学者通过研究CDw75 与胃癌的关系得出：被唾液酸化的CDw75 与胃癌的侵袭转移潜能密切相关。

本实验用免疫组化方法对人正常大肠黏膜、大肠腺瘤、淋巴结无转移大肠腺癌及淋巴结有转移大肠腺癌组织进行LEA 及CDw75 表达检测，并分析LEA、CDw75 表达趋势与大肠腺癌及其预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源样本选自昆明医科大学病理学教研室尸检及昭通市第一人民医院2008 年1 月～2012 年12 月期间进行手术切除、临床资料完整的存档蜡块，共126 例。其中，正常大肠黏膜11 例、大肠腺瘤43 例、淋巴结无转移大肠腺癌51 例、淋巴结有转移大肠腺癌21 例。所有标本均由2 位病理学专家复阅，尸检结肠黏膜组织来源者均无结直肠的病变，大肠腺癌标本剔除了黏液腺癌和印戒细胞癌。肿瘤诊断标准按2019 年消化系统肿瘤WHO 分类[7]进行。所有大肠腺癌患者术前和术后均未进行放疗和化疗。入围大肠腺癌患者均以电话方式进行随访，随访日期自病理报告确诊日期算起，至2021 年12 月31 日，并严格记录随访情况，72 例大肠腺癌患者随访到45 例，失访27 例；随访结局定义为死亡。

1.1.2 主要试剂ND-1 抗体购自Abcam，LN-1抗体购自SANTA cruz biotechnology，UltraSensitiveTM即用型超敏试剂盒（兔）、UltraSensitiveTM即用型超敏试剂盒（鼠）、DAB 显色加强型试剂盒、EDTA型抗原修复缓冲液等购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法

HE 及免疫组化：所有标本均为10%福尔马林固定、石蜡包埋，4 µm 厚连续切片，常规HE染色和免疫组化染色，免疫组化染色方法按试剂盒说明进行。ND-1 抗体（检测LEA）和LN-1 抗体（检测CDw75）的稀释浓度均为1∶250。LEA、CDw75 的阳性表达物呈淡黄～棕黄色颗粒，主要位于细胞膜和/或细胞质，散在或成团分布。采用双盲法观察切片，以半定量积分法[8]判断结果，评分由阳性细胞百分比及阳性强度综合评判得出。（1）阳性细胞百分比：阳性细胞数≤5%为0 分，6%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，＞ 75%为4 分；（2）阳性强度：无色为0 分，淡黄色为1 分，黄色为2 分，棕黄色为3 分。最终评分=阳性比率评分×阳性强度评分：0 分为阴性（-），1～4 分为弱阳性（+），5～8 分为阳性（++），9～12 分为强阳性（+++）。

1.3 统计学处理

应用SPSS21.0 统计软件包，采用Nonparametric Tests 中的Independent Samples 过程用于半定量积分计数资料；采用Kruskal-Wallis 秩和检验用于多样本间总体比较；各组之间行Mann-Whitney 两两比较，P＜ 0.05 为差异有统计学意义；生存分析使用Cox 回归模型。

2 结果

2.1 病例资料

11 例正常大肠黏膜组织标本（来源于尸检材料），年龄23～75 岁，平均57 岁；43 例大肠腺瘤组织标本，年龄27～75 岁，平均58 岁；51 例淋巴结无转移大肠腺癌组织，年龄33～75 岁，平均55 岁；21 例淋巴结有转移大肠腺癌组织，年龄23～75 岁，平均56 岁。高分化癌26 例，中分化癌28 例，低分化癌18 例。管状腺瘤26 例，绒毛状腺瘤17 例。

2.2 LEA 在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺癌组织中的表达

LEA 在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺癌组织中均有不同程度的阳性表达（图1～图4），且阳性表达有逐渐增强的态势，正常大肠黏膜、大肠腺瘤与大肠腺癌（包括淋巴结有转移和无转移）比较差异有统计学意义（P=0.000，P=0.006）；淋巴结有转移的大肠腺癌组织的阳性表达率虽略高于淋巴结无转移的大肠腺癌组织，但差异无统计学意义（P=1.000）；LEA 在高分化大肠腺癌中的表达低于中、低分化大肠腺癌，且高分化与中、低分化大肠腺癌之间差异有统计学意义（P=0.001 和P=0.000），LEA 在管状腺瘤与绒毛状腺瘤的表达差异也有统计学意义（P=0.023），见图5～图7 及表1～表3。

表1 LEA 在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺癌中的表达（n）Tab.1 The expression of LEA in normal colorectal mucosa，colorectal adenoma and colorectal carcinoma （n）

表2 LEA 在不同分化程度大肠腺癌中的表达（n）Tab.2 The expression of LEA in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation （n）

表3 LEA 在大肠腺瘤中的表达（n）Tab.3 The expression of LEA in colorectal adenoma （n）

图1 正常大肠黏膜LEA 呈弱阳性表达（SP×200）Fig.1 The weakly positive expression of LEA in normal colorectal mucosa （SP×200）

图2 大肠腺瘤LEA 呈阳性表达（SP×200）Fig.2 The positive expression of LEA in colorectal adenoma （SP×200）

图3 淋巴结无转移大肠腺癌LEA 呈强阳性表达（SP×200）Fig.3 The strong positive expression of LEA in colorectal adenocarcinoma without regional lymph node metastasis （SP×200）

图4 淋巴结有转移大肠腺癌LEA 呈强阳性表达（SP×200）Fig.4 The strong positive expression of LEA in colorectal adenocarcinoma with regional lymph node metastasis （SP×200）

图5 LEA 在正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠腺癌组织中的表达分布Fig.5 Distribution of LEA expression in normal colorectal mucosa, colorectal adenoma and colorectal adenocarcinoma

图6 LEA 在不同分化程度大肠腺癌中的表达分布Fig.6 Distribution of LEA expression in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation

图7 LEA 在大肠腺瘤中的表达分布Fig.7 Distribution of LEA expression in colorectal adenoma

2.3 CDw75 在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺癌组织中的表达

CDw75 在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺癌组织中均有不同程度的阳性表达（图8～图11），且阳性表达有逐渐增强的态势，正常大肠黏膜、大肠腺瘤与大肠腺癌（包括淋巴结有转移和无转移）比较差异有统计学意义（P=0.000，P=0.007），淋巴结有转移的大肠腺癌组织的阳性表达率虽略高于淋巴结无转移的大肠腺癌组织，但差异无统计学意义（P=1.000）；CDw75 在高分化大肠腺癌中的表达低于中、低分化大肠腺癌，且高分化与中、低分化大肠腺癌之间差异有统计学意义（P=0.000 和P=0.001），CDw75 在管状腺瘤与绒毛状腺瘤的表达差异也有统计学意义（P=0.000），见图12～图14 及表4～表6。

表4 CDw75 在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺癌中的表达（n）Tab.4 The expression of CDw75 in normal colorectal mucosa，colorectal adenoma and colorectal carcinoma （n）

表5 CDw75 在不同分化程度大肠腺癌中的表达（n）Tab.5 The expression of CDw75 in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation （n）

表6 CDw75 在大肠腺瘤中的表达（n）Tab.6 The expression of CDw75 in colorectal adenoma （n）

图8 正常大肠黏膜CDw75 呈弱阳性表达（SP×200）Fig.8 The weakly positive expression of CDw75 in normal colorectal mucosa （SP×200）

图9 大肠腺瘤组织CDw75 呈阳性表达（SP×200）Fig.9 The positive expression of CDw75 in colorectal adenoma （SP×200）

图10 淋巴结无转移的大肠腺癌组织CDw75 呈强阳性表达（SP×200）Fig.10 The strong positive expression of CDw75 in colorectal adenocarcinoma without regional lymph node metastasis （SP×200）

图11 淋巴结有转移的大肠腺癌组织CDw75 呈强阳性表达（SP×200）Fig.11 The strong positive expression of CDw75 in colorectal adenocarcinoma with regional lymph node metastasis （SP×200）

图12 CDw75 在正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠腺癌组织中的表达分布Fig.12 Distribution of CDw75 expression in normal colorectal mucosa, colorectal adenoma and colorectal adenocarcinoma

图13 CDw75 在不同分化程度的大肠腺癌中的表达分布Fig.13 Distribution of CDw75 expression in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation

图14 CDw75 在大肠腺瘤中的表达分布Fig.14 Distribution of CDw75 expression in colorectal adenoma

2.4 生存分析

纳入生存分析的病例数共45 例，生存27 例，死亡18 例。Cox 回归分析中可用案例加权后为1 086（占比42.2%），删失案例加权后为1 486（占比57.8%）；删除案例中，带有缺失值的案例、带有负时间的案例、层中最早事件之前删失的案例均为0。加权规则为年龄。

将患者生存时间的影响因素采用Cox 回归分析，协变量为患者性别、年龄、临床分期、淋巴结转移与否、LEA 和CDw75 表达情况，采用向前法进行变量筛选，结果显示患者性别、年龄、临床分期、LEA 和CDw75 表达是影响大肠腺癌患者预后的因素。年龄越大、临床分期越高、LEA 和CDw75 表达越强，患者死亡风险越大；男性患者的死亡风险大于女性患者，见表7 和图15。

图15 各协变量的均值水平的生存曲线Fig.15 Survival curves for the mean level of each covariate

表7 多因素 COX 比例风险回归模型Tab.7 Multivariate COX proportional hazards regression model

3 讨论

随着社会经济的发展，人类膳食结构的改变，膳食纤维在人们日常饮食中的比例日趋减少，导致大肠腺癌发病率逐年上升。有数据显示，世界上大肠腺癌正以2 %的平均速率呈连年上升趋势[9]，而在中国，大肠腺癌的发病增长率是国际水平的2 倍有余[10]，因此，大肠腺癌已成为严重威胁国人健康的危险因素之一。

从大肠腺瘤发展到大肠腺癌约7～l2 a[11]。要提高人类大肠腺癌的生存时限，唯有找到能及时发现、早期筛查大肠腺癌的诊断方法，或对大肠腺癌具有特异性的分子生物学指标。

3.1 LEA 在临床病理中的应用

据近几年的研究报道，LEA 是中、高分化大肠腺癌特异性较强的肿瘤相关抗原[5-6]。同时，众多实验研究发现，LEA 也存在于绒毛状腺瘤和重度异型腺瘤组织中，其含量与大肠绒毛状腺瘤组织中绒毛的数量和腺瘤细胞分化程度有关，伴随绒毛数量的增多、腺瘤细胞分化程度降低，LEA 含量逐渐增多，并与大肠腺癌中的含量逐渐接近，说明，在大肠腺瘤组织与大肠腺癌组织中含有共同的LEA 抗原[12]。笔者的实验结果也显示绒毛状腺瘤中LEA 表达增多，因此，对大肠腺瘤组织进行LEA 检测，或有助于预测大肠腺瘤的恶变倾向，对早期发现大肠腺癌提供又一新的检测指标。

已报道可用于大肠腺癌诊断的血清肿瘤标记物主要有CEA、CA19-9、CA50、CA242 等，这些肿瘤相关抗原的血清学检查均已普遍地应用于大肠腺癌的临床诊断和普查。其中，CEA 的应用最广泛，但CEA 的特异性不强，在大肠腺癌及其他肿瘤患者的血清中均可升高[13-14]。对某些内胚层来源的非大肠腺癌组织进行单克隆抗体ND-1对LEA 的特异性识别实验，发现LEA 在内胚层来源的非大肠腺癌组织中的表达阳性率要明显低于大肠腺癌组织[15]。

本实验发现，LEA 在大肠腺癌发生发展过程中表达逐渐升高，且在不同分化程度大肠腺癌中的表达差异有统计学意义，因此，笔者认为LEA在大肠腺癌发生发展中起一定的作用。

3.2 CDw75 在临床病理中的应用

CDw75 是一种人白细胞表面抗原，位于具有免疫球蛋白阳性表达的成熟B 淋巴细胞表面，是β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸转移酶产生的糖缀合物唾液酸化产物[16-20]。大多数恶性肿瘤患者死亡的直接原因是肿瘤的侵袭与转移[19]，而癌细胞之所以能发生侵袭和转移，是由于细胞表面糖蛋白和糖脂的组成及结构不断发生变化[16-17]。有研究显示，细胞表面的糖缀合物与细胞的增生、黏附、转移能力和免疫原性有重要关系[16-18]。其机理[21-22]可能是唾液酸降低了肿瘤细胞与Ⅳ型胶原的黏附、封闭了抗原决定簇、阻碍自然杀伤细胞的活性，并通过延长血浆中糖缀合物的半衰期诱导免疫耐受。

在胃肠道肿瘤研究中发现，CDw75 在胃黏膜上皮细胞的表达是其恶性转化和侵袭的标志，也是一个独立的胃癌预后因子[23]。有研究显示，CDw75 并不是β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸转移酶本身，而是β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸转移酶产生的糖缀合物唾液酸化产物。被唾液酸化的糖缀合物与肿瘤细胞的侵袭、转移能力密切相关[18,24-25]。

在本研究中，CDw75 在11 例大肠黏膜组织中只有1 例（9.09%）为阳性表达，而在72 例大肠腺癌组织中有51 例（70.83%）呈阳性表达，但将51 例淋巴结无转移大肠腺癌和21 例淋巴结有转移的大肠腺癌的CDw75 结果进行统计学分析，发现CDw75 与大肠腺癌是否伴有淋巴结转移差异无统计学意义。

本次研究认为LEA、CDw75 在大肠腺癌发生发展过程中有一定作用；患者性别、年龄、临床分期、LEA 和CDw75 表达是影响大肠腺癌患者预后的因素，年龄愈大、临床分期愈高、LEA 和CDw75 表达越强，患者死亡风险愈大；女性患者的死亡风险小于男性患者。在本次生存分析中显示有淋巴结转移的患者死亡风险比无淋巴结转移的患者小，笔者考虑可能是因为随访到的有淋巴结转移的病例数较少所致[因为从死亡率的占比来讲，有淋巴结转移患者的死亡率（50%，5/10）高于无淋巴结转移患者的死亡率（37.14%，13/35）]。