雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖、凋亡和炎症的影响及其调控机制

吴建霞，王越，薛丰田，陶玲玲

河南大学附属郑州颐和医院，郑州 450047

糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症之一。高糖可诱导足细胞损伤，从而加快糖尿病肾病病情进展。高糖引起的炎症反应等可诱导足细胞凋亡，进而加重足细胞损伤。既往研究显示［1-3］，木犀草素等成份具有抗炎等作用，可减轻高糖诱导的足细胞损伤，从而减轻肾脏损伤。雷公藤多苷含有生物碱等活性成份，具有抗炎、抗癌等作用，可减轻脂多糖诱导的星形胶质细胞炎症损伤［4］。但雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞损伤的影响及其可能作用机制尚未阐明。微小核糖核酸（miRNA）是长度为20～25 个核苷酸的非编码核糖核酸（RNA）分子，以碱基互补配对的方式与靶基因结合，可调控靶基因表达，在糖尿病肾病中异常表达并可参与足细胞损伤过程［5］。miR-150-3p 属于短链非编码RNA分子，其在糖尿病肾病中表达上调，可能与糖尿病肾病的发病机制有关［6］，但miR-150-3p 能否作为雷公藤多苷治疗糖尿病肾病的潜在靶标尚未可知。本研究采用高糖诱导人肾足细胞建立细胞损伤模型，探讨雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖、凋亡、炎症的影响及其对miR-150-3p 的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

雷公藤多苷（纯度>98%）购自湖南千金协力药业有限公司；人肾足细胞购自上海泽叶生物科技有限公司；DMEM 培养基购自美国Gibco 公司；miR-inhibitor-NC、miR-150-3p inhibitor、miR-mimics-NC、miR-150-3p mimics 购自广州锐博生物科技有限公司；兔抗人CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax 抗体购自美国Santa Cruz 公司；HRP标记山羊抗兔IgG 二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。

Lipofectamine 2000 转染试剂、Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；RevertAid RT 逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher 公司；MTT 试剂、凋亡检测试剂购自美国Sigma 公司；超敏C 反应蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP）、白 细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 分组

人肾足细胞于含5mmol/L 葡萄糖的培养液中培养48h，作为Control 组。人肾足细胞于含30mmol/L 葡萄糖的培养液中培养48h［7］，作为HG 组。人肾足细胞分别于含30mmol/L 葡萄糖和不同浓度（30、60、90mg/ml）雷公藤多苷的培养液中培养48h［8］，分别作为HG+Tri-30 组、HG+Tri-60 组、HG+Tri-90 组。将不含胎牛血清的细胞培养液与miR-inhibitor-NC、miR-150-3p inhibitor 混合后室温孵育5min（A 液），Lipofectamine 2000 转染试剂与不含胎牛血清的细胞培养液充分混合（B 液），A 液与B 液充分混匀后室温孵育20min，并将其加入人肾足细胞，转染6h 弃上清液后更换含30mmol/L 葡萄糖的培养液继续培养48h，分别记为HG+miR-inhibitor-NC 组、HG+miR-150-3p inhibitor 组。按照上述方法将miR-mimics-NC、miR-150-3p mimics转染至人肾足细胞后加入含30mmol/L 葡萄糖与90mg/ml 雷公藤多苷的培养液中培养48h，分别记为HG+Tri-90+miR-mimics-NC 组、HG+Tri-90+miR-150-3p mimics 组。

1.3 MTT 法检测细胞增殖

取人肾足细胞（1×105个/ml）接种于96 孔板（100μl/孔），按照“1.2”方法分组处理后加入MTT 溶液（20μl/孔）与二甲基亚砜（150μl/孔），充分混匀后室温孵育5min，并检测细胞吸光度（OD）值。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

取各组人肾足细胞加入预冷磷酸缓冲盐溶液，采用BY-80C 型台式低速离心机（济南来宝医疗器械有限公司）3000r/min 转速离心6min 后弃上清液，加入500μl 结合缓冲液重悬细胞，随后加入5μl Annexin V-FITC 与5μl 碘化丙啶（PI），充分混匀后室温孵育10min，应用FACS Calibur 流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 ELISA 法检测hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平

取各组人肾足细胞培养上清液，采用ELISA法检测hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 qRT-PCR 法检测miR-150-3p 表达水平

采用Trizol 法提取各组人肾足细胞总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA 浓度后置于-80℃超低温冰箱内保存。反转录体系：RNA 2μl，10×RT Buffer 2μl，dNTP 0.4μl，Multiscripe RT 1μl，10×Random Primer 2μl，RNase-Free ddH2O 补足体系至20μl。反应条件：25℃，10min；37℃，60min；95℃，5min；4℃保存。qRT-PCR扩 增 体 系：10×PCR Buffer 2.5μl，MgSO42.5μl，dNTPs 2.5μl，正、反向引物各0.5μl，cDNA 2μl，RNase-Free ddH2O 补足体系至25μl。反应条件：95℃预变性2min，95℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共36 次循环。采用qRT-PCR 荧光定量数据分析法计算miR-150-3p 的表达量。

1.7 Western blot 法检测CyclinD1、Bcl-2、 P21、Bax 蛋白水平

提取各组人肾足细胞总蛋白后检测蛋白浓度，加入5×SDS 上样缓冲液，沸水煮10min 后蛋白变性，将50μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳分离，并将其转移至PVDF 膜，室温封闭2h，加入一抗稀释液（CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax 与内参β-actin 1︰1000）后孵育过夜（4℃），使用TBST 洗涤后加入二抗稀释液（1︰2000），室温孵育1h 后滴加ECL 显影，应用ImageJ 软件分析各条带灰度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖的影响

与Control 组比较，HG 组OD 值、CyclinD1 蛋白水平降低，P21 蛋白水平升高（P<0.05）。与HG 组比较，HG+Tri-30 组、HG+Tri-60 组、HG+Tri-90组OD 值、CyclinD1 蛋白水平升高，P21 蛋白水平降低（P<0.05）。见表1 和图1。

图1 增殖相关蛋白表达

表1 雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖的影响 n=9，

表1 雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖的影响 n=9，

与Control 组比较，a：P<0.05；与HG 组比较，b：P<0.05

2.2 雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞凋亡和炎症因子的影响

与Control 组比较，HG 组凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05）。与HG 组比较，HG+Tri-30 组、HG+Tri-60 组、HG+Tri-90组凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05）。见表2 和图2。

图2 雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞凋亡和炎症因子的影响

表2 雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞凋亡和炎症因子的影响 n=9，

表2 雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞凋亡和炎症因子的影响 n=9，

与Control 组比较，a：P<0.05；与HG 组比较，b：P<0.05

2.3 雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞中miR-150-3p 表达水平的影响

与Control 组比较，HG 组miR-150-3p 表达水平升高（P<0.05）。与HG 组比较，HG+Tri-30 组、HG+Tri-60 组、HG+Tri-90 组miR-150-3p 表达水平降低（P<0.05）。见表3。

表3 雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞中miR-150-3p 表达水平的影响

2.4 沉默miR-150-3p 对高糖诱导的人肾足细胞增殖的影响

与Control 组比较，HG+miR-inhibitor-NC组OD 值、CyclinD1 蛋白水平降低，miR-150-3p 表达水平、P21 蛋白水平升高（P<0.05）。与HG+miR-inhibitor-NC 组比较，HG+miR-150-3p inhibitor 组OD 值、CyclinD1 蛋白水平升高，miR-150-3p 表达水平、P21 蛋白水平降低（P<0.05）。见表4 和图3。

表4 沉默miR-150-3p 对高糖诱导的人肾足细胞增殖的影响 n=9，

表4 沉默miR-150-3p 对高糖诱导的人肾足细胞增殖的影响 n=9，

与Control 组比较，a：P<0.05；与HG+miR-inhibitor-NC 组比较，b：P<0.05

图3 增殖相关蛋白

2.5 沉默miR-150-3p 对高糖诱导的人肾足细胞凋亡和炎症因子的影响

与Control 组比较，HG+miR-inhibitor-NC组凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05）。与HG+miR-inhibitor-NC 组比较，HG+miR-150-3p inhibitor 组凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05）。见表5 和图4。

图4 沉默miR-150-3p 对高糖诱导的人肾足细胞凋亡和炎症因子的影响

表5 沉默miR-150-3p 对高糖诱导的人肾足细胞凋亡和炎症因子的影响 n=9，

表5 沉默miR-150-3p 对高糖诱导的人肾足细胞凋亡和炎症因子的影响 n=9，

2.6 过表达miR-150-3p 减弱雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖、凋亡和炎症因子的影响

与HG+Tri-90+miR-mimics-NC 组比较，HG+Tri-90+miR-150-3p mimics 组OD 值和CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平降低，miR-150-3p表达水平、凋亡率、P21、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.05）。见表6和图5。

图5 过表达miR-150-3p 减弱雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖、凋亡和炎症因子的影响

表6 过表达miR-150-3p 减弱雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖、凋亡和炎症因子的影响 n=9，

表6 过表达miR-150-3p 减弱雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖、凋亡和炎症因子的影响 n=9，

3 讨论

炎症、氧化应激可引起足细胞损伤，因而如何抑制炎症及其引起的细胞凋亡成为研究重点，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯通过抑制内质网应激而抑制高糖诱导的足细胞凋亡［9］。葛根素通过抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）的表达而减轻足细胞损伤［10］。目前，雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞损伤的作用机制尚未阐明。

雷公藤多苷属于中药雷公藤的提取物，具有抗炎、抗免疫等作用，可保护肾脏，但其作用机制尚未阐明［11-12］。本研究结果显示，高糖诱导的人肾足细胞活力降低，而雷公藤多苷可提高高糖诱导的人肾足细胞活力。CyclinD1 与P21 可调控细胞周期而调节细胞增殖过程［13］。本研究进一步分析发现，高糖诱导的人肾足细胞中CyclinD1 的表达下调，P21 的表达上调，而雷公藤多苷可提高CyclinD1的表达水平及降低P21 的表达水平。提示雷公藤多苷可促进高糖诱导的人肾足细胞增殖。Bcl-2 属于抗凋亡蛋白；Bax 属于促凋亡蛋白，可激活线粒体途径而诱导细胞凋亡［14］。本研究结果显示，高糖诱导的人肾足细胞凋亡，抑制Bcl-2 的表达及促进Bax 的表达，而雷公藤多苷可降低高糖诱导的人肾足细胞凋亡，并可促进Bcl-2 的表达及抑制Bax的表达。提示雷公藤多苷可抑制高糖诱导的人肾足细胞凋亡。糖尿病肾病患者存在全身性炎症反应，hs-CRP、IL-1β、TNF-α的水平升高可促进糖尿病肾病发展［15］。本研究结果显示，高糖诱导的人肾足细胞hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，而雷公藤多苷可降低高糖诱导的人肾足细胞hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平。提示雷公藤多苷可抑制高糖诱导的人肾足细胞炎症反应。

为进一步探究雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞损伤的作用机制，本研究结果显示，高糖诱导的人肾足细胞中miR-150-3p 的表达水平升高，而雷公藤多苷可降低高糖诱导的人肾足细胞中miR-150-3p 的表达水平。提示雷公藤多苷可能通过抑制miR-150-3p 的表达，从而参与人肾足细胞损伤过程。miR-150-3p 在大鼠肺损伤中呈高表达，可能参与肺损伤发生过程［16］。miR-150 表达下调可保护肾脏免受心肌梗死引起的急性肾损伤［17］。本研究结果显示，沉默miR-150-3p 可提高高糖诱导的人肾足细胞活力，并可降低细胞凋亡率，还能降低hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平。提示沉默miR-150-3p 可促进高糖诱导的人肾足细胞增殖及抑制细胞凋亡、炎症反应。同时本研究结果显示，miR-150-3p 过表达可减弱雷公藤多苷对高糖诱导的人肾足细胞增殖、凋亡和炎症反应的作用。

综上所述，雷公藤多苷可能是通过降低miR-150-3p 的表达水平而促进细胞增殖及抑制细胞凋亡、炎症反应，从而减轻高糖诱导的人肾足细胞损伤。miR-150-3p 可能是雷公藤多苷减轻高糖诱导的人肾足细胞损伤的作用靶点，本研究为进一步揭示雷公藤多苷治疗糖尿病肾病的分子机制奠定了基础。