多线盘精卵生物学特性及几种因子对精子活力的影响

2022-07-29白冠星毕建启万正平梁银铨张志明

淡水渔业 2022年4期

杨洋,李林,白冠星,毕建启,万正平,陈锋,梁银铨,张志明

(1.水利部中国科学院水工程生态研究所，水利部水工程生态效应与生态修复重点实验室，湖北省水生态保护与修复工程技术研究中心，武汉 430079；2.广西大藤峡水利枢纽开发有限责任公司，南宁 530000；3.广州珠江水资源保护科技发展有限公司，广州 510000)

1 材料和方法

1.1 试验鱼

1.2 精液采集

用干净的毛巾擦干雄鱼生殖孔附近及体表的水分后，将雄鱼包裹在毛巾内，暴露出生殖孔，轻轻从前往后挤压雄鱼腹部，使精子流出。采集精液要求无水、尿、血和粪便，精液呈乳白色，入水立即散开。每次采集的精液在20 min内完成相关检测，避免保存时间过长影响实验结果。从50尾雄鱼中随机挑选10尾，用无菌移液枪收集雄鱼精子置于灭菌烧杯中混匀，显微镜下立即观察，每次试验观测30次，结果用平均数±标准差表示。

1.3 精子形态观察及密度和pH测定

将精液用0.9% NaCl溶液分化10 min后用无水乙醇固定，HE染色，在Nikon Eclipse 80i显微镜(400×)下观察精子形态，测量精子头长、头宽和鞭毛长等指标。

用0.9% NaCl溶液稀释精液400倍，用血球计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司XB.K.25.0.1 mm)在上光XSP-BM-8CA生物显微镜(100×)下计数，求出精子密度。

1.4 试验液的配置

1.5 精子活力观察

将精子运动状态划分为5个等级，分别为：激烈运动、快速运动、慢速运动、摇摆运动和死亡，以同一个视野内70%精子进入下一个时期来划分每个时期。从精子被激活到死亡的全部时间为精子寿命，在摇摆运动之前精子均能够使卵子受精，故将前三个运动总时间称为有效运动时间。

采集到的精液立即送至实验室，用移液枪吸取部分精液(<5 μL)于载玻片上，涂布均匀，放置于显微镜下，将显微镜调至可以观察到精子的合适位置(100×)，用移液枪加适量实验液激活精子，记录时间并观察精子运动情况。本次实验仅记录有效运动时间、寿命和激活率(被激活精子数量占精子总数的比值称为激活率)，观察结果以一个视野下精子为准。

由同一实验员进行精子活力、寿命及激活率的观测，并由另外一名实验员随机提供精子和实验液，避免观测实验员主观误差。

1.6 不同保存条件下多线盘精子活力观察

采集到的精液立即送至实验室，各取1 mL原液分装于5个10 mL无菌离心管中。将其中4个分别存放于-20、-4、4 ℃和室温(18 ℃)，另外一个添加9 mL蒸馏水配置的0.9% NaCl溶液(配置方法同上)混匀后也存放于室温(18 ℃)。每隔1 h观察各组精子活力(观察方法同上)并记录，直至每组精子活力均显著下降。

1.7 卵子的采集和形态学

1.8 繁殖力测定

1.9 统计分析

采用SPSS 17.0对本次试验的数据进行统计分析，采用Graph pad对处理后的数据进行图片的绘制。每组均测量30组数据，结果用平均数±标准差表示，<0.05判定为具有显著差异。

2 试验结果

2.1 精子密度、pH和形态学指标

图1 多线盘精子形态Fig.1 The sperm morphology of D.multilineatus Cui

2.2 不同水体对精子活力和寿命的影响

图2 不同水体对多线盘精子活力和寿命的影响(温度18 ℃)Fig.2 Effects of different water on sperm motility and sperm life span of D.multilineatus Cui(temperature 18 ℃)图标上方不同小写字母，表示存在显著性差异(P<0.05)，下图同。