一株大鲵虹彩病毒的分离及鉴定

喻大鹏，程 俊，夏洪丽，夏立群，蔡 佳，鲁义善

(1 广东海洋大学深圳研究院,深圳,518108;2 广东海洋大学 水产学院,广东湛江,524088;3 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江,524088;4 广东省水生动物健康评估工程技术研究中心,深圳,518018;5 武汉临空港经济技术开发区农业发展投资集团有限公司,武汉,430040;6 武汉晟丰农业开发有限公司,武汉,430040)

大鲵()，又名娃娃鱼，肉食性，常栖息于岩洞，滩口洞穴内，广泛分布于我国河北、河南、安徽、江苏、浙江、广东等地。由于其具有极高的药用、食用和营养价值，1980年前后在我国广东及东南亚地区兴起大鲵食用之风，在巨大利益驱使之下，出现大量盗捕和非法贩卖大鲵行为，导致野生大鲵数量急剧下降。为保护野生大鲵种群数量，在 21世纪初期，国家大力发展大鲵人工繁殖驯化。而随着人工养殖大鲵产业规模不断扩大及水环境恶化等问题突显，导致病原传播加剧，给大鲵人工养殖产业带来巨大经济损失。目前研究表明，引起大鲵病害的病原主要包括细菌[腐败希瓦氏菌()和嗜水气单胞菌()]、真菌[丝囊霉属()]、病毒[大鲵虹彩病毒(iridovirus)]和寄生虫[大鲵卷尾线虫新种(sp.nov)]。

大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)，又称大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV),属于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属()，大鲵虹彩病毒病是一种传播速度快，不易控制，死亡率高且难以防范的病毒病，对全世界大鲵养殖业均造成非常严重的影响。蛙病毒首次由GRANOFF等于 1966 年分离鉴定，其感染范围非常广泛，现今已有五十多个变温脊椎动物家族的上百种动物被蛙病毒感染致死的相关报道。而我国最早发现CGSIV是在2009 年的甘肃陇南与陕西汉中，患病大鲵死亡率高达90%以上。虹彩病毒感染大鲵初期，行动缓慢，无食欲，体表出现大量黏液；后期下颌出血，身体四肢皮肤溃烂发炎，肌肉坏死，严重者肢体断裂；解剖可见其体内肝脏、脾脏及头肾等免疫器官肿胀，肺部充血并存在大量出血点，腹腔及肠道内充满黄色液体。

本研究从广州某野生动物保护基地采集了患病死亡的大鲵样本，通过体表病患特征及内脏剖检结果，推测可能是由病毒引起突发性死亡。随后使用细胞系培养、透射电镜切片及分子生物学分析等方法，分离得到病毒株，确定是由CGSIV引发的死亡。本研究报道的结果为后续针对该病毒防控及免疫相关研究工作提供了参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020年5月从广东广州某野生动物保护基地采集三尾患病死亡大鲵体表溃疡处肌肉、脾脏和头肾等免疫组织，患病大鲵体长约2 m。发病时，大鲵长期蛰伏于水下，反应迟钝，食欲废绝，经检测水体温度和水质无异常。

1.2 细胞系、试剂与主要仪器

FHM细胞均由本实验室保存，M199(Hyclone)培养基，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS， Gibico)，ExDNA 聚合酶，DL 2000 DNA Marker 均购自TaKaRa 公司，DNA 提取试剂盒购自美国Omega公司；CO细胞培养箱购自Thermo Fisher公司;普通光学显微镜购自美国Leica公司；PCR仪购自德国耶那公司;引物合成及序列测定均由华大基因(广州)股份有限公司完成。

1.3 病原分离

将患病死亡大鲵在无菌条件下进行解剖，取其肌肉、脾脏、头肾及肝脏等组织样品，首先进行镜检；随后将解剖取出的各组织在LB固体平板和BHI固体平板上进行划线，28 ℃条件下过夜培养；剩余样品使用已灭菌剪刀剪碎置于研钵中，加入适量无菌PBS，反复加入液氮研磨，研磨破碎数次后，将该匀浆液转移至15 mL离心管中，然后在3000，4 ℃低温离心30 min，随后使用10 mL无菌注射器取上清液，经0.22 μm一次性无菌滤器过滤至无菌15 mL离心管中，-80 ℃冻存备用。

FHM细胞用参考文献[10]方法对细胞进行复苏并传代培养，随后将状态好的细胞接种于96孔细胞培养板上，分为三组，一组正常培养作为空白对照，一组添加50 μL无菌PBS作为阴性对照，一组添加等量过滤上清液为实验组，每组三个平行，每日置于显微镜下观察细胞状态，待实验组细胞出现80%以上CPE病变时，继续按照以上方法盲传三代，稳定能看到细胞CPE病变，随后将收获的病毒液于-80 ℃保存。

1.4 病毒滴度测定及细胞敏感性比较

将以上CGSIV病毒悬液按照10倍倍比稀释，稀释12个梯度备用；参考江育林等的方法进行病毒滴度(TCID)测定，计算CGSIV在细胞系中感染的滴度。

1.5 电镜样品制备

将1.3中盲传两代的病毒悬液接种于铺满FHM细胞的 T25 细胞培养瓶中，待细胞出现明显CPE后，收集细胞培养物，室温下1 000离心30 min，去除细胞培养液，收集细胞沉淀，并将其转移至细胞固定液中，4 ℃避光保存24 h，样品送由赛维尔公司进行切片处理，置于透射电子显微镜下观察、拍照。

1.6 分子克隆鉴定

将患病死亡大鲵的肝脏、脾脏、头肾及肌肉组织的总DNA使用 Omega DNA 提取试剂盒进行提取。参考文献[11]中GSIV病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因高度保守序列设计引物，引物如下：GSIV-F:5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′；GSIV-R：5′-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3′。参考江育林等PCR反应体系及反应条件，以上述提取的总DNA为模板，扩增MCP保守序列，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，随后送由华大基因(广州)股份有限公司进行测序。

1.7 PCR扩增产物序列分析

将测序得到的序列在BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.g2ov/Blast.cgi)上进行比对分析,然后选取 GenBank 中与测得序列相似的参考毒株MCP序列，采用分子生物学分析软件clustl X,和Mega 6.07构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 患病大鲵主要症状

患病大鲵初期出现食欲废绝，行动缓慢，长时间伏于水底，皮肤大量分泌粘液；感染后期，患病大鲵出现腹部肿胀(图1)，下颌和四肢充血(图1 A)，背部出现大量出血点(图1 B)，口腔溃疡。随着感染加剧，体表及四肢出血点增多扩大，开始溃烂，出现溃疡；解刨可见其体内肝脏、脾脏、肾等免疫器官肿胀(图1 C)，肺部充血并存在大量出血点，腹腔及肠道内充满黄色液体。发病一周内，患病大鲵相继死亡。

图1 CGSIV 感染大鲵的临床表现与剖解变化Fig.1 Clinical signs and anatomy changes of Chinese giant salamanders infected with CGSIVA；患病大鲵；B患病大鲵体表；C患病大鲵腹腔

2.2 分离病毒引起细胞病变

患病大鲵肌肉、脾脏、头肾及肝脏镜检无异常。从患典型症状的患病大鲵病灶组织取样,于LB固体平板和BHI固体平板上分别过夜培养后,均未分离到细菌，本次患病死亡大鲵症状与虹彩病毒感染引发的症状相同，而该病毒又能引起FHM细胞出现典型CPE病变(图2I)，故采用该细胞系进行回复感染实验，同时分离该病毒。病鲵组织经液氮研磨过滤除菌后，感染本实验室保存的细胞系FHM。盲传第一代时，FHM细胞经感染后，出现肿胀和破裂，仍有大量细胞贴壁；但盲传几代后，FHM细胞出现肿胀和破裂时间变短，大量细胞脱落。结果表明，FHM是CGSIV的敏感细胞系，多次感染使得CGSIV的毒性加强，感染FHM时间加快。

图2 CGSIV 感染FHM细胞后的细胞病变效应Fig.2 Cytopathic effect in FHM cells infected with CGSIV

2.3 大鲵虹彩病毒在FHM细胞中的滴度及病毒粒子形态

根据TCID计算CGSIV在FHM细胞中的滴度，结果表明CGSIV在FHM细胞中的滴度为10TCID/mL 。经透射电镜观察被感染细胞，可见细胞内存在大量直径约100～120 nm、具有囊膜的正六边形病毒颗粒(图 3)。

图3 GSIV 感染 FHM 细胞的超薄切片电镜观察Fig.3 Electron microscopy observation of CGSIV in infected FHM cellsA,B,C：透射电镜下同一视野下不同放大倍数病毒颗粒

2.4 MCP基因鉴定与序列分析

从患病死亡大鲵肌肉、脾脏、头肾及肝脏等组织样品基因组DNA中均扩增到预期大小431 bp的DNA片段(图4)；测序后进行多序列比对分析。结果发现该DNA序列和NCBI上蛙病毒属病毒大鲵虹彩病毒(基因登录号：ALL53143)的MCP蛋白编码基因高度同源，高达99%(图5)；结合病毒形态特征与PCR鉴定结果，确定引起本次大鲵突发性死亡的病毒为大鲵虹彩病毒。

图4 CGSIV MCP 基因的 PCR 扩增结果Fig.4 PCR amplified products of the CGSIV MCP geneM：Marker；1：阴性对照；2：肌肉；3：脾脏；4：肾脏；5：肝脏

图5 根据CGSIV MCP基因序列构建的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on CGSIV MCP gene sequence of isolated virus.“▲”：分离病毒CGSIV-GZ

3 讨论

虹彩病毒是一类具有广谱感染性的DNA病毒，既能感染脊椎动物，又能感染无脊椎动物，可感染宿主高达上百种。虹彩病毒病流行范围广泛，是水产养殖中常见的病毒性疾病。近些年来，我国已有虹彩病毒感染牛蛙()、鳖()、大鲵()、大菱鲆()、鳜()、牙鲆()、石首鱼()和大口黑鲈()等引发死亡的报道。根据第十次国际病毒分类委员(International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV)会决定，将虹彩病毒科分为：肿大细胞病毒属()、绿虹彩病毒属()、虹彩病毒属()、淋巴囊肿病毒属()和蛙病毒属()五个病毒属。虹彩病毒科的病毒结构相似，在透射电镜下观察呈六角形，二十面体对称结构，病毒粒子通常为120～200 nm，最大直径可达350 nm。该科病毒不耐高温，不耐强酸强碱；同时其囊膜极易被有机溶剂和胰蛋白酶破坏，感染能力大大降低。本研究从患病大鲵病灶处取样，经液氮反复充分研磨，可使病毒从细胞中释放，且低温不会使病毒失活，可以继续感染细胞，随后将被感染细胞由透射电镜拍照，发现其非常符合虹彩病毒科形态特征结构，初步判断引起本次大鲵死亡的病因可能是被虹彩病毒科病毒感染。

由于不动杆菌属()和气单胞菌属()等菌属感染大鲵引起的病变与CGSIV感染的表型特征相似，同时有可能出现细菌与病毒混合感染的情况，因此患病大鲵临床解剖结果只可作为初步判断依据，尚需进一步鉴定。本研究根据CGSIV的MCP蛋白序列高度保守区一对引物，从病鲵病灶脾脏和肾脏组织中扩增出大约431 bp片段，经公司测序及序列比对，发现该病毒属于虹彩病毒科蛙病毒属病毒。由此可见，引发本次野生大鲵突发性死亡的病因是虹彩病毒科蛙病毒感染所致。本研究所用检测方法为常规PCR检测，用时较长，同时需要专业人员在实验室进行操作。现如今随着分子生物学技术和病毒分子生物学鉴定技术的发展，越来越多的新技术应用于水产养殖病害检测中。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技术和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术已经用于检测CGSIV，相比于普通PCR检测耗时短，操作简单，更适合早期诊断。

本研究报道的患病大鲵初期出现的症状和后期病变均与国内外报道的CGSIV感染症状相似。以往报道对大鲵以上病变，归类与是细菌感染引发，通常都是以细菌做为主要病因来分析，并未进行病毒分离检测，因此出现此类症状，均被认为是条件致病菌感染所致。在本次病发过程中，基层工作人员在此前从(未死亡)病鲵病灶部位分离到条件致病菌，做完药敏试验后，根据药敏结果给病鲵体表涂抹或口服抗菌药物均无任何效果。外国学者DEBRA等在牛蛙()与林蛙()的研究中，同样出现此种情况，他们认为是由于CGSIV感染宿主，其免疫器官是病毒感染主要部位，导致宿主免疫力下降，使得宿主菌更易被致病菌感染，当作为细菌病去治疗时，并不能达到预期效果。综合以上结果，发现并非本次感染主要病因，引发本次大鲵突发性死亡的病因是CGSIV。

研究表明，CGSIV感染发病速度快，极易扩散，容易发生继发性感染，死亡率高，市面上尚没有CGSIV治疗特效药。CGSIV结构复杂，病毒来源和感染宿主广泛，在养殖过程中需要保证养殖池洁净、饵料来源安全及按期消毒设施设备，以免病毒扩散。王芳等和余波等发现患大鲵虹彩病毒病大鲵腹腔注射头孢拉定和渔用氟苯尼考后，配合Vitamine C+E浸泡具有一定效果。将未患病大鲵连续一周浸泡黄芪多糖、电解多维和葡萄糖，提高大鲵免疫力，大大降低被感染的概率。同时国外研究学者COUPAR等发现阿昔洛韦(ACYCLOVIR)对CGSIV感染也具有一定抑制作用。此外，蜂胶、黄芪、菊花、人参、金银花、芍药等具有广谱抗病毒作用的中草药可以添加到日常饵料中，按时投喂，达到预防作用，但中草药成分复杂、特异性差、作用机理、剂量、价格和效果不稳定，且缺乏数据支撑，有待进一步研究。而疫苗具有持续时间长、针对性强、安全系数高等优点，是目前治疗CGSIV感染最佳选择之一。早在2013年，孙建滨等制备的两种灭活疫苗对CGSIV感染具有非常好的疗效。贾秋红等通过对病鲵注射自制CGSIV灭活疫苗，治疗期间同时注射自制的中西药结合的抗病毒药物，迅速遏制了CGSIV的传播，使得该养殖场无持续死亡病例。而曾宪辉等以CGSIV的MCP基因构建核酸疫苗，接种疫苗后的获得高达73.3%的免疫保护率，表明该疫苗在CGSIV的预防过程中具有潜在的应用价值。