碱胁迫下“鲟龙1号”(Huso dauricus♀×Acipenser schrenckii♂)鳃组织结构变化及转录表达特征

杨合霖，张 颖，王念民，徐 伟，吕伟华

(1．上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江省冷水性鱼类种质资源及增养殖重点开放实验室，哈尔滨150070)

鲟隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)鲟形目(Acipenseriformes)，是现存起源最早的脊椎动物之一，具有极高的科研价值。鲟鱼籽营养丰富，制成的鱼子酱价格昂贵，素有“黑色黄金”之称。中国的鲟鱼产业发展迅猛，鲟鱼养殖产量和鱼子酱产量世界领先，20世纪90年代初至今，中国的鲟鱼养殖品种不断增多，其中 “鲟龙1号”(♀×)为中国第一个自主选育获得的杂交鲟新品种，相比其他鲟科鱼类，该品种兼具个体大、生长快与性腺发育早等优势。

1 材料方法

1.1 试验材料

“鲟龙1号”幼鱼(简称杂交鲟)采集于中国水产科学研究院北京房山鲟鱼工程繁育中心，并于黑龙江水产研究所呼兰基地进行试验，试验鱼约为30日龄，体长为(133.17±16.75) mm，体重为(12.43±3.99) g。本试验设置了1个对照组(C)与1个胁迫组(T)，每组设三个平行。对照组为自来水，实际测定碱度为3.13 ～ 3.20 mmol/L，胁迫组为自来水添加99%纯度的食用小苏打(哈尔滨市呼兰区三鑫制碱厂)的稳定溶解液，实际测定碱度为14.4 ～16.67 mmol/L，每个养殖缸养殖15尾，共90尾。

试验前于自来水中驯养2周，养殖水温为17～21 ℃，溶氧量大于6 mg/L，日投喂2次(天邦鲟鱼颗粒配合饲料)，日投饵率为1%～1.5%。试验开始后每2日更换相同碱度新水，持续增氧曝气，并保持水质清洁。于试验第30天，采集鳃组织，保存于Bouin′s固定液，并于24 h后转入70%酒精中保存，每个平行各取3尾备用。另取鳃装入冻存管后用液氮临时保存，于-80 ℃冰箱保存备用，每个平行各取5尾混合为一个重复，每组共采3个重复。

1.2 试验方法

1.2.1 鳃的石蜡切片制作与观察

将鳃修成小块(3 mm×3 mm×3 mm)，分别置于70%、80%、90%、95%和100%(2次)的酒精中进行梯度脱水，并置于二甲苯 ∶酒精(1 ∶1)、二甲苯(2次)中梯度脱去酒精，再置于二甲苯 ∶石蜡(1 ∶1)、软蜡和硬蜡除去二甲苯，进行石蜡包埋；用MICROM HM 200切片机切片，切片厚度为4 μm；将获得的切片置于二甲苯、二甲苯 ∶酒精(1 ∶1)、100%酒精、90%酒精、80%酒精和清水，逐步除去组织内的石蜡、二甲苯和酒精，并进行苏木精·伊红(H·E)染色；染色后的切片逐步置于70%酒精、80%酒精、90%酒精、100%酒精、二甲苯 ∶酒精(1∶1)、二甲苯(2次)；采用中性树胶封片，并用Leica DMI 6000B拍照观察。

1.2.2 RNA提取及RNA-seq测序

利用 RNA easy Lipid Tissue Mini Kit(QIAGEN，Germany)提取总RNA。利用nanodrop 8000仪器检测各RNA样品的纯度和浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳极检测RNA的完整性。RNA-seq测序委托上海欧易生物医学科技有限公司(上海)完成，利用 Illumina HiseqTM 2500平台进行高通量测序。

1.2.3 测序数据分析

测序数据去除接头、重复及低质量数据后，利用Trinity软件将数据全部混合拼接获得Unigene，并进行转录注释及表达量的计算。利用 DESeq 进行基因的差异表达分析，并进行聚类分析。使用DEseq2 方法进行差异基因检测，<0.05视为差异表达。利用GO数据库对差异表达基因进行功能注释和富集，运用KEGG数据库进行通路分析，FDR≤0.01和Fold Change≥2视为显著富集。使用Cytoscape软件构建代谢通路互作网络。

1.2.4 数据处理

数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示。为保证试验的准确性和可重复性，组织显微结构设3个生物重复，转录组测序设3个生物重复，5尾鱼混为一个重复。用SPSS 22进行单因素方差分析和Duncan多重比较，显著性水平设为<0.05。

2 结果与分析

2.1 鳃组织结构的病理变化分析

鳃组织切片观察显示，对照组的鳃小片为扁平囊状，细长，呈梳状排列，鳃小片由单层上皮细胞、毛细血管和柱状支持细胞组成，上皮细胞呈扁平状，核梭形，柱状支持细胞核大而圆，与基膜相连，鳃丝及鳃小片中含有氯细胞，少量分布(图1-a)。与对照组相比，胁迫组的鳃丝与鳃小片发生肿胀，鳃丝血管壁上有大量扁平细胞与柱细胞增生，泌氯细胞数量增加，鳃小片发生卷曲、融合，鳃上细胞脱落、游离(图1-b)。显微结构测量结果显示，胁迫组的氯细胞略有膨大，与对照组差异不显著，鳃小片宽度和鳃小片间距显著增大，差异显著(<0.05)(表1)。

图1 杂交鲟幼鱼对照组与胁迫组的鳃丝组织切片(H·E)Fig.1 Tissue section of gill filament of juvenile hybrid sturgeon of control group and stress group(H·E)“a”为对照组；“b”为胁迫组；BC： 血细胞；CSC：氯细胞；GL： 鳃小片；PC： 柱细胞；PVC： 扁平上皮细胞

表1 对照组和胁迫组杂交鲟幼鱼鳃丝的显微结构Tab.1 Gill filaments of Juvenile hybrid sturgeon in microscope of control group and treatment group

2.2 测序数据过滤结果及组装

对鳃的6个样品进行转录组测序，质控后共获得有效碱基(CleanData)为40.22 G，各样品的有效数据量分布为 5.78～7.31 G，去除接头序列、低质量序列后，各样品Q30 为96.11%～96.23%，GC 含量为45.65%～74.29%(表2)。结果表明，该测序质量可靠，构建文库可用于后续分析。使用 Trinity软件paired-end 的拼接方法，根据序列相似性以及长度，挑选出最长的一条作为Unigene，获得去冗余的Unigene共 80 422条，总长度为88 658 788 bp，N50为1759 bp，最长序列为32 175 bp，最短序列为301 bp。

表2 测序数据统计表Tab.2 Summary of RNA-seq dates

2.3 差异表达基因聚类分析

差异表达基因的聚类结果显示，对照组与胁迫组有1 507个基因差异表达，其中694个基因差异表达上调，813个基因差异表达下调(图2)。此外，差异表达基因分别聚类，同组样本的不同重复表达相似(图3)。

图2 对照组与胁迫组差异表达基因火山图Fig.2 Volcano map of DEGs between control group and stress group

图3 对照组与胁迫组差异表达基因热图Fig.3 Heat map of DEGs between control group and stress groupC1、C2与C3为对照组；T1、T2与T3为胁迫组。

2.4 GO功能分类

将Unigene比对到GO数据库进行功能分类，结果显示，差异表达基因为371个，其中87个基因上调，284个基因下调，富集到的生物过程包括钠离子跨膜输出(sodium ion export across plasma membrane)、细胞钾离子稳态(cellular potassium ionhomeostasis)和精氨酸代谢过程(arginine metabolic process)等，差异基因均显著表达下调(<0.05)；富集到的细胞组分包括顶端质膜(apical plasma membrane)、微绒毛(microvillus)和钠/钾交换ATP酶复合体(sodium:potassium-exchanging ATPase complex)等，其中，顶端质膜组分与钠/钾交换ATP酶复合体组分中的差异表达基因均显著下调，微绒毛组分中包括7个基因显著下调表达与1个基因显著上调表达。富集到的分子功能包括钠/钾交换ATP酶活性(sodium:potassium-exchanging ATPase activity)、精氨酸酶活性(arginase activity)和硫转移酶活性(sulfotransferase activity)等，其中钠/钾交换ATP酶活性功能与精氨酸酶活性功能的差异表达基因均显著下调，硫转移酶活性功能中包括4个基因显著下调表达与1个基因显著上调表达(图4)。

图4 Top 30差异表达基因GO富集结果Fig.4 GO enrichment of top 30 of DEGs 显著性水平为P<0.05。

2.5 KEGG通路富集及主效应表达通路分析

将Unigene比对KEGG数据库进行富集，结果显示，在主要富集通路中，近曲小管碳酸氢盐再生(ko04964:Proximal tubule bicarbonate reclamation)中8个基因显著表达下调；矿物吸收(ko04978:Mineral absorption)中7个基因显著表达下调；胃酸分泌(ko04971：Gastric acid secretion)中10个基因显著表达下调。筛选21个显著富集的KEGG代谢通路，构建代谢通路互作网络，结果显示，近曲小管碳酸氢盐再生途径为主效应途径(图5)。

图5 KEGG显著富集通路相互作用网络Fig.5 Network of significantly enriched pathways in KEGG红色代表显著上调通路，绿色代表显著下调通路(P<0.05)。大圆形图标代表主效应途径，小圆形图标代表次效应途径。

参考KOG数据库，近曲小管碳酸氢盐再生代谢通路的主要差异表达基因为3、1、1和，分别参与合成钠/氢交换蛋白3型(NHE3)、钠/钾ATP酶α亚基(NKAα)、钠/钾ATP酶β亚基(NKAβ)和谷氨酸脱氢酶(GLDH)等(表3)。

表3 近曲小管碳酸氢盐再生通路(ko0496)差异表达基因及编码蛋白Tab.3 The DEGs and protein of Proximal tubule bicarbonate reclamation pathway(ko0496)

3 讨论

研究表明，低碱条件下，鱼类可以改变氯细胞等鳃上细胞的形态来适应水质的变化，但随着碱度上升，鱼类在碱的刺激下会分泌大量粘液，粘液凝结于鳃丝表面，会直接抑制氯细胞的生理功能，当盐碱浓度超过鱼类的承受力时，鱼类的鳃组织结构会造成器质性损伤，甚至威胁到鱼类的生存。本研究中，碱胁迫下“鲟龙1号”的鳃组织已经发生了明显的病理损伤，鳃小片发生卷曲、融合，鳃上细胞发生脱落、游离，该结果与黑龙江泥鳅()、大鳞副泥鳅()、和奥尼罗非鱼和黄河鲤()等相似，表明碱度为14.4 ～16.67 mmol/L的条件下，“鲟龙1号”的渗透压平衡与呼吸功能已经受到影响。

进行GO富集与KEGG富集，并构建基因共表达网络，差异表达基因主要富集到钠离子跨膜输出与细胞钾离子稳态等生物进程，以及矿物质吸收与近曲小管碳酸氢盐再生等代谢通路，其中3、1、1与等基因主要参与了调控。NHE3是钠/氢交换蛋白家族的第三个亚型，由3编码，主要存在于上皮细胞基底膜，可对细胞内外H和Na进行电中性跨膜交换，对鱼类适应非等渗环境有重要作用。研究发现，NHE3参与尿钠的重吸收，敲除小鼠()的3后，小鼠对碳酸氢钠的重吸收减少了50%～60%。本研究中3基因响应表达下调，推测“鲟龙1号”采取减少重吸收的策略来降低血液离子浓度，从而维持渗透压平衡，该结果符合鱼类在高渗水环境的渗透调节规律，但关于碱胁迫下“鲟龙1号”的血清离子变化模式仍有待研究。NKA是动物细胞膜上普遍存在的跨膜结合蛋白，主要由α与β亚基构成，分别由1与1基因编码，可通过亚基的构象变化，泵入3个Na同时释放2个K，从而参与调节静息电位与渗透压的平衡。研究发现，尼罗罗非鱼()的基因响应碱度变化，碱胁迫下，尼罗罗非鱼的血清离子浓度迅速升高，基因的mRNA表达水平随离子浓度而产生变化，随着离子浓度下降，的 mRNA表达水平又趋于恢复。大鳞鲃()在高盐碱下，由于碱度高于耐受范围，离子转运体系负荷，NKA酶活力降低甚至低于正常水平。 本研究1与1基因均显著表达下调，表明碱度已高于耐受范围，离子转运功能下降，可能与鳃损伤有关。 GLDH是一种重要的线粒体酶，由基因编码，可催化谷氨酸的氧化分解，生成产物α-酮戊二酸与氨，促进鱼类的排氨作用。本研究中，基因显著下调表达，表明鳃损伤已导致排氨功能下降，排泄功能也受到了影响。综上，碱胁迫下，“鲟龙1号”的鳃组织发生了病理损伤，鳃上细胞的矿物质重吸收、钠/钾离子转运与排氨等功能下降。