多聚赖氨酸对梨果采后青霉病防效及其抗性诱导机制

窦 勇， 胡佩红， 田林双， 吴存兵

(1.江苏财经职业技术学院粮食与食品药品学院，江苏淮安 223003； 2.淮安正昌饲料有限公司技术部，江苏淮安 223008)

梨(Nakai)属于蔷薇科植物，梨果营养丰富，富含多种维生素和纤维素，具有利于消化、通便、去咳化痰和保护心血管的效果。在自然情况下，梨果采摘后生理衰变速度快，组织一旦受到机械损伤，极易受到霉菌侵染，腐烂率极高，食用品质急剧下降，极大地降低了梨果的商品价值。据统计，梨果采后贮藏保鲜技术水平有限，因包装、贮运到上市销售过程中生理病害及机械损伤引起的霉菌感染造成的经济损失约30%。梨果采后由真菌引起的病害主要为扩展青霉()引起的青霉病及由灰葡萄孢()引起的灰霉病，其中青霉病是影响梨果商品价值的最主要病害，它不仅会引起梨果腐烂变质，部分致病青霉菌还会分泌展青霉素(patulin，简称PAT)，PAT对人类具有明显的致癌、致畸、致突变作用，严重危害消费者生命健康。目前，控制梨果采后病害的方法包括物理方法、化学方法、生物控制方法。Li等发现用紫外线处理梨果，能有效控制梨果采后霉菌病害，其腐烂直径显著低于对照组。李自芹用0.7 g/L的水杨酸或0.15%苯甲酸钠处理库尔勒梨果，可有效控制库尔勒梨果采后黑头病，并保存良好的储藏品质。张奇儒从果园里分离筛选出1株可有效控制梨果采后青霉病的酵母菌，该菌经鉴定为异常威克汉姆酵母，经毒理学研究表明该菌安全、无毒，使用浓度为1×10个/mL的异常威克汉姆酵母对梨果采后青霉病的控制效果最佳。梨果采后病害的物理控制方法具有安全、无毒的优点，但物理方法操作繁杂且费用高。而生物防治目前研究主要集中于安全无毒的拮抗酵母的筛选，由于在梨果病害防治过程中存在酵母菌活力下降的不足之处，造成推广运用存在一定的阻碍。化学防治方法具有显著的防病效果，目前使用最为普遍，但化学杀菌剂存在一定的药物残留，危害消费者健康，且在使用过程中会对环境造成一定程度的污染，此外一些食品防腐剂如山梨酸钾及苯甲酸钠也可在一定程度上控制梨果采后病害，但其只能抑制霉菌生长，不能杀灭霉菌，对病害控制效果有限。

多聚赖氨酸(poly--lysine，简称PL)是一种常见的食品防腐剂，它是由多个赖氨酸单体组成的直链状多聚体，分子式为CHNOn，是由白色链霉菌属的生产菌产生的次级代谢产物，经分离提取精制而获得的发酵产品，进入人体后可分解为赖氨酸，因此PL安全无毒。本研究针对造成梨果采后损失最严重的病害青霉病，通过打孔处理和整果处理方法，研究PL对梨果采后青霉病的控制效果和其对梨果储藏品质的影响，探明其控制梨果采后青霉病的最佳使用浓度，并初步探讨其抗性诱导机制，以期使PL能在梨果采后病害防控及贮藏保鲜中得到应用。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验时间为2021年3月20日至5月30日，在江苏财经职业技术学院粮食与食品药品职业技术学院食品加工技术实验室完成。

1.2 主要仪器

试验仪器主要有TopPette单道可调移液器[大龙兴创实验仪器(北京)股份公司]、MS104TS/02电子天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]、LHS-250SC型恒温恒湿培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、AP-0650010血球计数板(德国MARIENFELD公司)、GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.3 供试材料

1.3.1 供试水果 试验用正常商业成熟度的梨果(Shuijing)，选择个体大小基本一致，没有机械损伤和病虫害，且未经任何商业防腐处理的梨果。用体积分数为0.2%的NaClO溶液浸泡处理梨果 1 min，再用自来水冲洗干净后晾干备用。

1.3.2 供试病原菌 选择自然腐烂长满青霉菌的梨果上分离出的青霉菌，经生理生化和分子生物学鉴定该菌为扩展青霉菌，为梨果的致病菌。挑取1环青霉菌孢子接种于20 mL马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)培养基中，25 ℃培养24 h，吸取0.1 mL孢子悬浮液均匀涂布于马铃薯葡萄琼脂培养基(PDA)上，在 25 ℃ 下培养7 d。7 d后，在培养基中加入无菌生理盐水，用无菌的移液管头轻轻刮取青霉菌孢子，用血球计数板测定孢子悬浮液浓度，用无菌生理盐水稀释至1×10个/mL，备用。

1.3.3 主要试剂 试验主要试剂有次氯酸钠(化学纯，购自国药化学试剂有限公司)、多聚赖氨酸(分析纯，购自国药化学试剂有限公司)。

1.4 试验方法

1.4.1 多聚赖氨酸打孔处理对梨果采后青霉病的控制效果研究 采用无菌打孔器在供试梨果赤道处均匀打3个孔，孔径为4 mm×3 mm，将20 μL不同浓度的多聚赖氨酸溶液(200、400、600、800、1 000 mg/L)分别注入小孔里，对照组注入等量的无菌生理盐水。将其置于已用乙醇消毒后的塑料筐中，用聚乙烯薄膜覆盖包裹好，置于恒温恒湿箱中，于相对湿度为96%、20 ℃条件下储存24 h。用移液枪将20 μL浓度为1×10个/mL的青霉孢子悬液注入孔中，相同条件下，储存6 d，每隔1 d统计梨果腐烂情况，并测定腐烂直径。试验分6个处理，每个处理12个梨，试验重复3次。

1.4.2 多聚赖氨酸整果处理对梨采后青霉病的控制效果研究 根据“1.4.1”节的试验结果，采用抑制梨果腐烂效果最佳浓度的多聚赖氨酸，浸泡供试梨3 min，同样在梨的赤道处用无菌打孔器打3个孔，孔径为4 mm×3 mm，注入20 μL/孔浓度为 1×10个/mL的青霉孢子悬液，梨置于经乙醇消毒后的塑料方框内，用聚乙烯薄膜包裹好并置于恒温恒湿箱中，设置温度为20 ℃，相对湿度为96%，储存 6 d，每隔1 d统计腐烂情况，并测定腐烂直径，腐烂直径为腐烂孔的直径，未腐烂孔的腐烂直径定义为0。试验分6个处理，每个处理12个梨，试验重复3次。

1.4.3 多聚赖氨酸整果处理对梨采后储藏品质的影响 根据“1.4.2”节的试验结果，采用整果处理控制青霉病效果最佳浓度的多聚赖氨酸，浸泡供试梨3 min，以无菌生理盐水为对照组。用聚乙烯薄膜覆盖包裹好置于恒温恒湿箱中，于20 ℃，相对湿度96%的条件下，储存60 d后，测定梨的可滴定酸含量、维生素C含量、硬度、可溶性固形物含量、失重率、褐变度，并统计其腐烂率和腐烂直径，各指标测定方法如下：

可滴定酸含量：参考韩雅姗的方法。每隔 5 d 进行酸碱滴定法的测定，可滴定酸含量以苹果酸含量计(折算系数为0.067)。

维生素C含量：使用紫外分光光度法，波长选择在最大吸收峰243 nm处测定吸光度，计算供试苹果中维生素C的含量。

硬度：参考 Gunness等的方法，采用TA-XT2i 质构分析仪对梨果的硬度进行测定。

可溶性固形物含量：采用全自动折光仪进行测定，结果以百分比计。

失质量率：苹果储存前后的质量差，结果以百分比计。

自然腐烂率：统计苹果腐烂情况，计算腐烂率。

褐变度()：参考蔡孟轩等的研究结果，波长选择在最大吸收峰420 nm处测定吸光度。

1.4.4 多聚赖氨酸处理梨对其抗性酶活性的影响试验分为2组，每组15个梨。试验组使用600 mg/L的多聚赖氨酸溶液浸泡3 min，对照组使用无菌的生理盐水浸泡3 min。风干后，置于事先准备好的已用乙醇消毒后的塑料筐中，再用聚乙烯薄膜包裹好放进恒温恒湿箱中，储存6 d，分别测贮藏0、2、4、6 d后梨苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)的活性。取2 g梨果果肉(皮下0.2～10.0 mm)，立即用液氮迅速冷冻后与少量硅砂混合，置于预冷的研钵中，研磨至粉末。加入1 mL含0.038%乙二胺四乙酸(EDTA)和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的预冷PBS (50 mmoL/L，pH值7.8)，溶解粉末并转移到离心管中，剩余的组织用9 mL的PBS洗涤收集，然后在4 ℃下以10 000 r/min离心 5 min，收集上清液用于测定PAL、PPO、POD活性(单位为U/g)。

1.4.4.1 苯丙氨酸解氨酶活性的测定 取1 mL上清液于比色皿中，加入3 mL硼酸盐缓冲液，于 290 nm 处测定吸光度。在37 ℃的水浴锅中水浴 60 min，再次测定吸光度，以1 mL 50 mmoL/L的 PBS (pH值=7.8) 为空白对照。计算2次的吸光度差，以吸光度每升高0.01为1个PAL酶活单位。

1.4.4.2 多酚氧化酶活性测定 吸取2.8 mL的 0.1 mmol/L 邻苯二甲酚(50 mmol/L PBS，pH值为6.4)溶液于比色皿中，加入0.2 mL待测粗酶提取液，30 ℃保温6 min，于398 nm处测定吸光度，每隔1 min自动测定1次，连续测定3次。以吸光度上升0.01为1个PPO酶活单位。

1.4.4.3 过氧化物酶活性测定 将0.2 mL粗酶提取液，加入到2.2 mL，50 mmol/L PBS(pH 值为6.4，含0.3%愈创木酚)中。再加入0.6 mL 0.3%的HO(50 mmoL/L PBS，pH值6.4)，30 ℃保温 6 min，于470 nm处测定吸光度，每隔1 min自动测定1次，连续测定3次。采用0.2 mL 50 mmoL/L PBS(pH值=6.4)作为空白对照。POD酶活单位定义为吸光度每上升0.01为1个酶活单位。

2 结果与分析

2.1 多聚赖氨酸打孔处理对梨采后青霉病控制效果的研究

由图1、图2可知，多聚赖氨酸浓度为600 mg/L的试验组与对照组相比，在贮藏3～5 d内腐烂率和腐烂直径较低。浓度在0～600 mg/L时，随着浓度的增大，其对梨果青霉病的抑制效果整体逐渐增大。当浓度达到800 mg/L以上时，控制效果开始减弱，达到1 000 mg/L时，基本没有抑制效果，可能是因为多聚赖氨酸浓度过大，破坏了梨果细胞结构造成的。在贮藏6 d时，只有600 mg/L试验组腐烂率未达到100%，且腐烂直径最低，说明打孔处理后，浓度为600 mg/L的多聚赖氨酸对梨果采后青霉病的控制效果最佳。

2.2 多聚赖氨酸整果处理对梨采后青霉病的控制效果研究

图3是梨果经浓度为600 mg/L的多聚赖氨酸浸泡处理3 min后接种青霉孢子，贮藏3 d后的腐烂情况，由图3可知，多聚赖氨酸有效地控制了梨果的青霉病害。由图4、图5可知，贮藏6 d内，梨果的腐烂率和腐烂直径均显著低于对照组。从腐烂率来看，在贮藏的前5 d，对照组的腐烂率迅速升高，且贮藏4 d腐烂率已超过50%；而处理组腐烂率升高幅度较低，基本保持在40%以内，且在前3 d，尚未腐烂，到贮藏6 d时，腐烂率迅速升高至88.35%。从腐烂直径来看，试验组从贮藏4 d时开始腐烂， 腐烂直径增大缓慢，贮藏6 d时，试验组的腐烂直径为15.74 mm相比对照组的43.43 mm显著降低了63.76%。由此可见，600 mg/L多聚赖氨酸整果处理梨果可以有效控制采后青霉病。

2.3 多聚赖氨酸整果处理对梨采后储藏品质的影响

由表1可知，经600 mg/L多聚赖氨酸整果处理的梨果，在贮藏60 d后，腐烂率为2.12%，而对照组的腐烂率达到15.27%，多聚赖氨酸显著降低了梨果贮藏期的腐烂。处理组硬度显著高于对照组(<0.05)，而失质量率显著低于对照组，说明多聚赖氨酸对梨果具有一定的保水效果。在可滴定酸含量、可溶性固形物含量、维生素C含量、褐变度等贮藏品质指标上，处理组与对照组差异不显著。由此可见，多聚赖氨酸整果处理梨果，既能有效控制梨果采后青霉病，对梨的储藏品质也不会产生不良影响，在一定程度上提高了贮藏品质。

表1 多聚赖氨酸整果处理对梨采后自然腐烂率及贮藏品质的影响

2.4 多聚赖氨酸打孔处理对梨果PPO、POD、PAL活性的影响

2.4.1 多聚赖氨酸对梨PPO活性的影响 由图6可知，对照组和处理组PPO活性都呈先上升后下降的趋势，但处理组PPO活性整体显著高于对照组。在贮藏4～6 d处理组和对照组PPO活性差别达到最大，多聚赖氨酸处理组梨果的PPO活性约为对照组的1.69～2.09倍。说明梨果经过多聚赖氨酸诱导处理后，抗性酶PPO活性显著提高，有效地提高了梨果对青霉病的抗病力。

2.4.2 多聚赖氨酸对梨 POD 活性的影响 从图7可知，对比试验组与对照组的试验结果，POD活性变化趋势基本一致，均是呈先上升后下降的趋势，但多聚赖氨酸处理组POD活性整体显著高于对照组。对照组与试验组的差异在贮藏6 d达到最大值，处理组梨POD活性为91.45 U/g，对照组POD活性为63.41 U/g。

2.4.3 多聚赖氨酸对梨 PAL 活性的影响 从图8知，PAL活性均呈先上升后平缓的趋势，处理组PAL活性下显著高于对照组。从贮藏4 d开始，对照组和处理组的PAL活性均处于较高值，处理组PAL活性基本是对照组酶活性的2倍以上，说明经多聚赖氨酸处理的梨果的抗性酶PAL活性显著提高，增强了梨果的抗病力。

3 讨论与结论

PAL、PPO、POD是植物细胞中最重要的3种抗性防御酶，当病原菌侵染植物体时，植物组织细胞会通过提高PAL、PPO、POD的活性来防御外来病原菌的侵染，且这3种酶活性与抗病性呈正相关，因此可作为衡量植物抗病性的指标。梨果经多聚赖氨酸打孔处理诱导24 h，能够明显提高抗性酶PAL、PPO、POD的酶活性，从而提高了梨果对青霉病的抗性，通过对照组与试验组的对比表明，多聚赖氨酸溶液浓度在200～600 mg/L条件下，随着溶液浓度的增加，对梨青霉病的腐败率和腐败直径抑制效果逐渐加强；在600 mg/L条件下，对梨青霉病的抑制效果最好，能最大程度地减少青霉病对梨造成的伤害；在600 mg/L以上，抑制效果开始减弱，当浓度达到1 000 mg/L时，对梨青霉病基本没有抑制效果，可能是因为高浓度的多聚赖氨酸会破坏梨细胞组织，引起自身防御系统故障。梨果浸泡经浓度为600 mg/L多聚赖氨酸处理3 min的梨，储存60 d后，试验组腐烂率和腐烂直径均明显低于对照组。由此可见，多聚赖氨酸不仅对梨果青霉病具有显著的控制效果，而且在一定程度上保护了梨果的储藏品质，有效延长了梨果的贮藏期。

在目前的生产实践中，梨青霉病的防治主要还是依靠化学方法进行，化学方法往往存在农药残留，食用后对人体会存在一定的影响，甚至会产生环境污染。多聚赖氨酸作为一种天然的食品防腐剂，进入人体后可以被分解为赖氨酸，被人体正常消化吸收，具有安全无毒的优点，此外多聚赖氨酸又具有明显的抑菌效果，被广泛应用于食品防腐剂中。本研究结果表明600 mg/L的多聚赖氨酸浸泡处理梨果，能有效控制梨果采后青霉病，且多聚赖氨酸安全无毒，对梨果感官品质具有较好的保护作用，因此，多聚赖氨酸在梨果采后保鲜和贮藏中将有较高的应用价值。本课题后续研究将会拓展到多聚赖氨酸对梨果黑霉病控制、草莓采后病害、苹果采后病害控制等方面，以期其能在水果采后病害控制方面得到推广应用。