2株薏苡内生菌促生特性及其对种子萌发的影响

普凤雅， 谷书杰， 何永宏， 杨志清，，3

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201； 2.云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室，云南昆明 650201；3.云南农业大学西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，云南昆明 650201)

植物内生菌在植物体内的存在具有普遍性和多样性的特点，目前研究认为内生菌与宿主植物在长期共处中形成了一种复杂、特殊的互利共生关系。植物内生菌可以通过提高植物体内生长素和分裂素的代谢，促进植物的细胞分裂、根系发育、幼苗生长，如产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶、吲哚-3-乙酸(IAA)等；还可以提高植物的固氮、溶磷、解钾作用，以及产生嗜铁素、羧甲基纤维素酶等促进植物对环境中有益物质的吸收能力。如在缺铁的土壤环境中，植物会利用嗜铁素产生菌产生的铁载体满足植物对铁元素的需要；在逆境下，ACC脱氨酶能够降低乙烯含量来促进植物生长发育，缓解植物所受胁迫。Adnan等研究发现，解磷细菌能够改善石灰性土壤中作物的生长发育和对磷元素的吸收。赵青云等的研究表明，接种解磷微生物显著增加了香草兰植株干质量、土壤有效磷含量；王雪菲的研究表明，解磷细菌能够提高白菜的农艺性状和生物量；接种解磷细菌和丛枝菌根真菌显著提高了苜蓿地上生物量、株高、茎粗、粗蛋白含量等。

薏苡(-L.)属于禾本科(Gramineae)玉蜀黍族(Maydeae)薏苡属()，是我国传统的药食同源植物，具有较高的营养和药用价值。目前国内外对薏苡促生菌的相关报道较少，筛选薏苡促生菌并研究其促生特性对薏苡生长发育、薏苡仁产量、品质、有效活性成分积累有一定的帮助，对推动薏苡产业发展具有重要意义。本研究以前期分离得到的2株薏苡内生菌为研究对象，通过测定2株薏苡内生菌分泌嗜铁素、羧甲基纤维素酶、ACC脱氨酶的能力，探究这2株内生菌促进作物生长的生理机制；通过种子萌发试验评价2株薏苡内生菌及其混合菌液对薏苡种子萌发和幼苗生长的影响，同时也探究薏苡促生菌对禾本科作物(玉米、水稻、大麦、小麦)种子萌发和幼苗生长的影响；以期为稳定薏苡产量、减少化肥施用以及为后期薏苡生物菌肥的开发利用提供理论依据和物质基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 本试验于2019年12月在云南农业大学农学与生物技术学院云南省高校作物种质创新及可持续利用重点实验室进行。所需菌株由云南农业大学农学与生物技术学院作物种质创新与可持续利用重点实验室分离保存，编号为L21的菌株分离自文薏2号叶片，经笔者所在课题组鉴定为贝莱斯芽孢杆菌()，编号为R24的菌株分离自文薏2号根部，经鉴定为短小芽孢杆菌()。

1.1.2 培养基 LB培养基：蛋白胨10 g、酵母粉 5 g、氯化钠10 g、蒸馏水1 000 mL，固体培养基在此基础上加入17 g琼脂，121 ℃灭菌20 min。

铬天青(CAS)铁载体检测培养基、MKB培养基、DF培养基、ADF培养基按照刘璐的方法进行配制；羧甲基纤维素钠培养基和产酶培养基按照吴静的方法进行配制。

1.1.3 供试作物品种 玉米：点谷1号；水稻：滇禾优55，大麦：北青7号，小麦：云麦53；以上品种均由云南农业大学农学与生物技术学院作物种质创新与可持续利用重点实验室提供。薏苡：文薏2号和师薏1号，由云南省文山州农科院提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株产嗜铁素能力的定性和定量分析 (1)定性检测。将内生菌菌株点接种至铬天青固体培养基中，30 ℃恒温培养48 h，观察菌落周围是否出现透明圈，出现透明圈即说明菌株产生嗜铁素。计算可溶性指数：可溶性指数=，其中：代表透明圈直径，代表菌落直径。(2)定量测定。将菌液接种于液体 MKB培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养，分别在培养24、36、48、60、72 h后取上清液5 mL，5 000 r/min 离心10 min，保留嗜铁素发酵上清液(SCS)，将嗜铁素发酵上清液(3 mL)和CAS(3 mL)溶液以1 ∶1的体积比混合均匀，暗反应 1 h，用分光光度计测反应液在 630 nm 处的吸光度，记为。取3 mL未接种MKB液体加入等体积的 CAS 检测液，其余操作相同，吸光度记为。

1.2.2 菌株产羧甲基纤维素酶能力的定性和定量分析 定性检测：将内生菌菌株点接种至纤维素酶鉴别培养基中，30 ℃恒温培养48 h后，加入刚果红溶液，再加入氯化钠溶液脱色。观察菌落周围是否产生纤维素水解圈，产生纤维素水解圈则说明菌株可产生纤维素酶。

定量测定：将产生纤维素酶的菌株接种至纤维素酶产酶培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养，分别在培养24、36、48、60、72、84 h后取上清液5 mL，5 000 r/min 离心10 min，采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定菌株的纤维素酶活性和滤纸酶活性。

1.2.3 ACC脱氨酶活性的测定 将供试菌株在液体LB培养基中活化过夜，4 ℃、8 000 r/min离心 10 min，用无菌水收集菌体沉淀并将其重新悬浮于ADF培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养过夜后按照秦宝军等的方法测定ACC脱氨酶的活性。

1.2.4 菌株对种子萌发和幼苗生长的影响 菌液准备：将供试菌株接种于液体LB培养基中，35 ℃过夜培养，4 ℃、8 000 r/min离心收集沉淀，无菌水重悬，调节菌悬液浓度为1×10CFU/mL备用。T1处理：浓度为 1×10CFU/mL的L21菌液；T2处理：浓度为1×10CFU/mL 的R24菌液；T3处理：浓度为1×10CFU/mL的L21和R24等比例复配的菌液；以无菌水处理作为对照(CK)。

将所供试的种子用75%乙醇溶液消毒10 min，用无菌水洗净，晾干后置于以上菌液中浸种4 h，待风干后再放置于铺有无菌滤纸的培养皿中，25 ℃条件下进行培养，定时检查湿度，确保滤纸潮湿。定时记录种子的萌发数(以胚根突破种皮1 mm为标准)，直至第10天。第4天计算发芽势，第10天计算发芽率，并测定作物的鲜质量、芽长、根长、根系活力(用2，3，5-氯化三苯基四氮唑法测定)。

发芽率=(发芽种子数/供试种子总数)×100%；

发芽势=(4 d内发芽种子数/供试种子总数)×100%；

发芽指数()=∑/，其中：为每天的发芽数，为发芽天数；

活力指数()=×，其中：为平均幼苗长度(芽长+根长)。

1.3 数据分析

采用 Excel 2010 和SPSS 25.0对数据进行记录、整理、统计和分析；对不同菌株处理的小组进行组间单因素方差分析比较。

2 结果与分析

2.1 菌株嗜铁素合成能力测定结果

2.1.1 定性测定结果 从图1中可看出，2株内生菌在CAS检测平板上均可以生长并产生透明圈，R24菌株的透明圈大于L21菌株。可溶性指数可初步判断菌株产嗜铁素的能力，该值越大其分泌的铁载体在培养基中的分布范围越大，即其在相同培养条件和时间下产生铁载体的能力越强。本研究中2株供试菌株可溶性指数均在1.5以上，可溶性指数表现为R24菌株>L21菌株(表1)。

表1 嗜铁素合成能力定性测定结果

2.1.2 定量测定结果 由图2可知，随着培养时间的增加，菌株分泌嗜铁素的能力逐渐增强，培养到60 h时R24和L21菌株分泌嗜铁素的能力最强，嗜铁素相对含量分别为95.80%、90.08%。在整个培养过程中，R24菌株分泌的嗜铁素相对含量均大于L21菌株，这与“2.1.1”节中的结果一致。

2.2 羧甲基纤维素酶活性和滤纸酶活性测定

2.2.1 定性测定结果 2株菌株均能在羧甲基纤维素酶鉴别培养基中形成纤维素水解圈(图3)，说明2株菌都能产生羧甲基纤维素酶。可溶性指数越大表明菌对纤维素的降解能力越强，由表2可知，菌株R24的可溶性指数为5.29，L21的可溶性指数为5.11，降解纤维素酶的能力表现为R24菌株>L21菌株。

表2 羧甲基纤维素酶定性检测结果

2.2.2 定量测定结果 将菌株在发酵培养基中培养24、36、48、60、72、84 h后上清液的纤维素酶活性和滤纸酶活性测定结果如图4和图5所示；随着培养时间的延长，菌株的羧甲基纤维素酶活性和滤纸酶活性呈现出先增大后减小的趋势，在培养72 h后R24和L21菌株的羧甲基纤维素酶活性和滤纸酶活性均达到最大值，分别为0.28、0.61 U/mL和0.86、1.43 U/mL。2株菌的羧甲基纤维素酶活性均低于滤纸酶活性，菌株L21的羧甲基纤维素酶活性和滤纸酶活性均高于菌株R24。

2.3 ACC脱氨酶含量测定结果

将菌株在ADF培养基中30 ℃、200 r/min条件下培养过夜后弃上清液收集菌体，测得ACC脱氨酶活性如图6所示，ACC脱氨酶酶活性表现为L21菌株>R24菌株，其ACC脱氨酶活性分别为2.30、2.00 μmol/(μg·h)。

2.4 菌株对种子萌发和幼苗生长的影响

2.4.1 不同处理对种子萌发的影响 由表3可知，T1、T2、T3处理均能提高薏苡、玉米、水稻、大麦、小麦种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数，其中，处理效果最佳的是T1处理，T2处理次之。在T1处理下，文薏2号、师薏1号、滇禾优55、云麦53的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数与CK相比差异均达到极显著水平(<0.01)；点谷1号的发芽率、发芽势、活力指数和北青7号的发芽势、发芽指数、活力指数与CK相比差异也达到极显著水平(<0.01)。T1处理下文薏2号和师薏1号的发芽率分别为95.56%、84.44%，较无菌水处理分别增加了13.16%、28.80%；发芽势分别为82.22%、76.67%，较CK分别增加了19.35%、25.46%；发芽指数分别为43.69%、41.81%，较CK分别增加24.30%、34.09%；活力指数分别为17.03、15.63，较CK分别增加160.80%、84.32%。

表3 不同处理对种子萌发的影响

2.4.2 不同处理对作物根系生长的影响 由图7可知，T1、T2、T3处理均能够促进薏苡、玉米、水稻、大麦、小麦的根系生长，T1处理下，所有供试材料的根系生长与CK相比差异都达到极显著水平(<0.01)，其中，效果最佳的是文薏2号，其根长较CK增加了292.85%。T2处理下，文薏2号、师薏1号、滇禾优55、云麦53和北青7号的根长与CK相比差异达到极显著水平(<0.01)，点谷1号的根长与CK相比差异达到显著水平(<0.05)。T3处理下，师薏1号的根长较CK增加了22.08%，并与CK相比差异达到极显著水平(<0.01)；文薏2号和云麦53的根长与CK相比差异达到显著水平(<0.05)；点谷1号、滇禾优55、北青7号的根长分别比CK增加了8.05%、8.89%、55.56%，但是与CK相比差异均未达到显著水平。

2.4.3 不同处理对作物芽长的影响 由图8可知，T1、T2、T3处理均提升了供试作物芽的生长，处理效果表现为T1处理>T2处理>T3处理。除北青7号外其余供试材料在T1和T2处理下与CK相比差异均达到极显著水平(<0.01)。在T3处理下，师薏1号和云麦53的芽长与CK相比差异达到极显著水平(<0.01)；点谷1号和滇禾优55的芽长与CK相比差异达到显著水平(<0.05)；文薏2号和北青7号的芽长分别比CK增加了3.81%和3.41%，但差异未达到显著水平。不同处理下幼苗的生长状态详见图9。

2.4.4 不同处理对作物鲜质量的影响 由图10可知，T1、T2、T3处理能够促进作物的生长发育，增加供试作物的鲜质量。在T1处理下，所有供试作物的鲜质量与CK相比差异均达到极显著水平(<0.01)。在T2处理下，文薏2号、师薏1号和点谷1号的鲜质量与CK相比差异均达到显著水平(<0.05)，滇禾优55、云麦53和北青7号的鲜质量与CK相比差异均达到极显著水平(<0.01)。在T3处理下，点谷1号和云麦53的鲜质量与CK相比差异均达到显著水平，文薏2号、师薏1号、滇禾优55和北青7号的鲜质量分别显著较CK增加了3.44%、10.76%、10.89%、6.00%，但差异均未达到显著水平。

2.4.5 不同处理对作物根系活力的影响 由图11可知，T1、T2、T3处理均能够提高供试作物的根系活力。在T1和T2处理下，所有供试材料的根系活力与CK相比差异均达到极显著水平(<0.01)；在T1和T2处理下，文薏2号的根系活力较CK分别增加了205.04%和171.35%。在T3处理下，除了云麦53，其余供试材料的根系活力与CK相比差异均达到极显著水平(<0.01)。

3 讨论与结论

植物促生菌能够有效提高植物对土壤养分的吸收利用、改善土壤耕层环境以及田间生态环境，还能通过自身作用或者产生代谢产物来缓解逆境对植物的伤害，从而来促进植物生长，在作物生产和生态环境方面都具有一定的潜能。本研究利用L21和R24这2株薏苡内生菌来探究其促生长的特性，结果表明，2株薏苡内生菌均能够产生嗜铁素、ACC脱氨酶和羧甲基纤维素酶。在本研究中，产生嗜铁素能力最强的是分离自文薏2号根系的R24菌株，摇瓶60 h后嗜铁素相对含量为95.80%，高于吴娟丽等在土壤中分离得到的E7和W7菌株的嗜铁素相对含量，但是菌株产生的嗜铁素的种类需要进一步研究。梁烨等的研究表明，接种含ACC脱氨酶的根际促生细菌后，在各种盐碱处理条件下，大豆地上部和根系的干质量均增加。本研究中，2株薏苡内生菌L21和R24菌株的ACC脱氨酶活性为2.30、2.00 μmol/(μg·h)。促生菌株可以通过利用能够降解纤维素的微生物，把秸秆降解为腐殖质物质，增加土壤肥力，从而促进作物生长。在本研究中，2株菌中产生羧甲基纤维素酶和滤纸酶能力最强的是分离自文薏2号叶片的菌株L21，其活性分别为0.61、1.43 U/mL，2株菌的羧甲基纤维素酶活性均低于滤纸酶活性。在筛选羧甲基纤维素酶高产菌株的过程中发现，在定性筛选培养基平板上水解圈较大的菌株经发酵培养基培养后测得的酶活性不高，其原因可能是筛选所用的固体培养基和发酵所用的液体培养基培养条件不同；另外，筛选培养基的厚度和菌落菌体量的差异也会影响水解圈的大小。

韩丽珍等的研究结果表明，HGD12溶磷菌株显著促进了辣椒和花生种子的萌发，对辣椒和花生幼苗植株的鲜质量、株高及根长均有显著的促生作用。汪焱等的研究结果表明，促生菌对植物种子的萌发和幼苗的生长具有一定的促进作用；蔡红丹等的研究结果表明，用溶磷细菌处理过的水稻种子出苗速度、出苗整齐度和发芽率最好。本研究通过种子萌发试验探究了2株薏苡内生菌及其混合菌液对其宿主植物薏苡以及其他禾本科作物(玉米、水稻、大麦、小麦)种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明，L21、R24菌株均能显著提高宿主植物薏苡以及玉米、水稻、大麦、小麦种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、根系活力以及幼苗生长；其中，经L21和R24菌株处理的文薏2号的根长较无菌水处理分别增加了292.85%和260.71%，说明菌株L21和R24具有极强的促生长能力，主要表现在促进其根系的生长发育，且L21菌株的效果更佳；L21和R24菌株的等比例混合菌液与CK相比，在种子萌发和幼苗生长方面促进效果显著，但是低于L21和R24菌株单独处理的效果，可能的原因是2株菌在营养物质和生态位等方面有竞争关系。综上可知，L21和R24菌株能显著促进作物苗期生长发育，可作为后续研制生物菌肥的优良菌株资源。本研究结果为薏苡减肥增效提供了理论依据和基础，对推动薏苡产业发展具有重要意义。