hnRNP A2/B1蛋白在结直肠癌组织中的表达变化及其与患者预后的关系

王颖，王智娜 ，马洪明，高鸿，张楠

1应急总医院应急管理部医务室，北京 100028；2应急总医院肿瘤内科

目前结直肠癌的手术和辅助治疗方面取得了相当大的进步，但患者病死率仍然很高，5年总生存率低于65%[1]。结直肠癌的TNM分期系统与肿瘤分级对预测预后具有重要意义，但因其异质性，仍需探寻不同蛋白在结直肠癌发生和发展中的作用。hnRNP家族是在可变剪接过程中发挥重要作用的RNA结合蛋白家族[2]。hnRNP几乎参与mRNA代谢的全过程，这些hnRNP蛋白在mRNA的处理（RNA剪接、稳定性、转运和翻译）、DNA修复、端粒、细胞信号转导以及转录水平和转录后水平上都有不同程度的作用。越来越多的证据表明，hnRNP极有可能参与肿瘤发生机制，如血管生成、细胞凋亡、细胞侵袭和上皮—间质转化等[3]。hnRNP A2/B1是hnRNP家族的重要成员之一。本研究观察了hnRNP A2/B1蛋白在结直肠癌组织中的表达变化，并分析其与患者预后的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 组织标本来源 收集2017年3月—2020年3月我院根治性结肠切除术中留取的结肠癌患者肿瘤组织标本212例和与之相匹配的癌旁正常组织标本（距离切缘＞5 cm）58例。患者男116例、女96例，年龄21～87岁。排除术前新辅助治疗（化疗或放疗）、复发性结直肠癌、遗传性结直肠癌患者，合并其他已知恶性肿瘤的患者。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 肿瘤组织中hnRNP A2/B1蛋白检测 采用免疫组化法和 Western blotting法。免疫组化法[4]：将结直肠癌组织和正常组织使用石蜡包埋、甲醛固定，做4µm厚切片，加入一抗（抗人hnRNP A2/B1多克隆抗体，1∶100）4℃过夜，加入二抗（辣根过氧化物酶结合的抗小鼠抗体）37℃下孵育15 min，最后用DAB染色试剂盒进行染色，苏木精反染后密封，阴性对照用磷酸盐缓冲盐水代替一抗；由两位高年资病理科医生进行独立双盲阅片，hnRNP A2/B1表达于细胞核和细胞质，以细胞核和（或）细胞质出现棕黄色颗粒为阳性；采用H-score半定量方法[5]，根据染色强度（I）和阳性细胞百分比（PC）进行赋分，以∑（I×PC）计算最终得分，范围为0～300分。根据免疫组化积分的近中位值将结直肠癌标本分为高表达组（积分≥100分）和低表达组（积分＜100分）。Western blotting法检测操作步骤参考文献[6]。以GAPDH为内参，Image J软件分析条带的IntDen值作为蛋白相对表达量。

1.3 预后随访 随访5年，记录无病生存、疾病复发和因结直肠癌死亡情况，记录总生存期（OS）和无病生存期（DFS）。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。hnRNP A2/B1表达与结直肠癌临床病理参数的关系分析采用Pearsonχ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank分析法。预后影响因素分析采用Cox回归分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hnRNP A2/B1蛋白在结直肠癌及癌旁组织中的表达比较 hnRNP A2/B1在结肠癌细胞和正常结肠腺细胞的细胞核和细胞质中均有表达，hnRNP A2/B1在结直肠癌组织中主要在细胞核中表达。结直肠癌及癌旁组织中hnRNP A2/B1蛋白表达积分分别为（134.7±74.1）、（34.6±11.0）分，高表达组90例、低表达组122例；Western blotting法检测结直肠癌及癌旁组织中hnRNP A2/B1蛋白相对表达量分别为227 254±45 678、34 987±4 509。hnRNP A2/B1在结直肠癌组织中的表达高于相应正常结肠组织（P均＜0.05）。

2.2 结直肠癌不同临床病理特征患者hnRNP A2/B1蛋白表达比较 Ⅲ、Ⅳ期患者hnRNP A2/B1蛋白高表达者所占比例高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P均＜0.05），不同年龄、性别、术前CEA水平、原发肿瘤位置（结肠或直肠）、肿瘤大小、肿瘤病理分型、肿瘤分化程度的患者hnRNP A2/B1蛋白表达情况差异无统计学意义。见表1。

表1 结直肠癌不同临床病理特征患者hnRNP A2/B1蛋白表达比较[例（%）]

2.3 hnRNP A2/B1蛋白表达与结直肠癌患者预后的关系 高表达组无病生存、疾病复发和因结直肠癌死亡的患者比例分别为31.1%（28/90）、27.8%（25/90）、41.4%（37/90），低表达组分别为 86.1%（105/122）、6.5%（8/122）、7.4%（9/122），高表达组无病生存患者比例低于低表达组，疾病复发和因结直肠癌死亡的患者比例高于低表达组（P均＜0.05）。高表达组平均OS（45.36±3.96）月、中位OS 41月，DFS（29.51±2.00）月、中位DFS 26月；低表达组OS（65.94±2.08）月、中位OS未到达（OS中死亡者未达到本组病例的50%），DFS（62.36±2.32）月、中位DFS未到达（DFS中出现疾病进展者未达到本组病例的50%）。高表达组OS和DFS短于低表达组（P均＜0.05）。进一步去除侵袭范围浅、无转移、临床预后较好的Ⅰ期患者及已经有远处转移的Ⅳ期患者，分析发现，hnRNP A2/B1表达与154例Ⅱ～Ⅲ期结直肠癌患者的生存时间相关，高表达组OS[分别为（46.97±3.08）、（54.78±2.08）月]和DFS[分别为（33.49±2.29）、（52.03±2.22）月]短于低表达组（P均＜0.05）。在90例Ⅱ期结直肠癌患者中，高表达组OS[分别为（50.10±5.20）、（58.69±1.30）月]和DFS[分别为（35.26±2.18）、（54.83±2.67）月]短于低表达组（P均＜0.05）。但在64例Ⅲ期结直肠癌患者中，高表达组和低表达组OS和DFS差异无统计学意义（P均＞0.05）。多因素Cox回归分析结果显示，hnRNP A2/B1蛋白表达与TNM分期是结直肠癌患者OS和DFS的独立影响因素。见表2。

表2 结直肠癌患者OS和DFS影响因素回归分析结果

3 讨论

人hnRNP A2/B1基因位于染色体7p15上，编码蛋白异构体hnRNP A2和B1，在细胞核和细胞质之间穿梭来发挥作用[7]。hnRNP A2/B1在胰腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中均有表达，并已经发现与肿瘤、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等多种疾病有关[8]。此外，hnRNP A2/B1高表达与一些肿瘤细胞的侵袭行为有关。然而，hnRNP A2/B1在结直肠癌中的表达情况及与患者临床预后的关系尚不明确。本研究采用免疫组化法和Western blotting法进行定性和半定量分析，发现与癌旁正常结肠组织相比，hnRNP A2/B1蛋白在结直肠癌组织中高表达，与其他肿瘤相关研究结果相似。我们发现，hnRNP A2/B1蛋白在结直肠癌组织和正常结肠组织的细胞核和细胞质中均有表达。然而，在结直肠肿瘤组织中，其主要定位于细胞核，尤其是中、高分化的结直肠癌组织，而在低、中分化的结直肠癌组织中，其同时也在细胞质中表达。原发性肝细胞肝癌相关研究表明，hnRNP A2/B1表达位置的变化（同时在细胞核、细胞质中表达与仅在细胞核中表达相比）可能与肿瘤进展相关，这与我们的研究结果相似[9]。此外，本研究发现，hnRNP A2/B1高表达与结直肠癌TNM分期相关。生存分析显示，hnRNP A2/B1表达变化与结直肠癌患者的预后相关，高表达组预后差。Cox多因素分析进一步表明，hnRNP A2/B1高表达和TNM分期都是结直肠癌预后的独立影响因素，这与胰腺癌[10]、肺癌[11]、肝细胞癌[12]相关研究结果相似。结直肠癌患者的群体异质性大，预后差异较大，尤其是Ⅱ～Ⅲ期结直肠癌。本研究除去侵袭范围浅、无转移且临床预后较好的Ⅰ期结直肠癌患者及已经有远处转移的Ⅳ期结直肠癌患者，生存分析结果显示，在Ⅱ～Ⅲ期患者、Ⅱ期患者中，高表达组OS和DFS均短于低表达组。约有一半的结直肠癌患者确诊时处于Ⅱ～Ⅲ期[13-14]，这些患者即使已行结直肠癌根治术，仍会有15%～30%的Ⅱ期患者及50%～60%的Ⅲ期患者由于局部和（或）远处转移而在术后死于结直肠癌[14-15]。本研究结果提示，hnRNP A2/B1表达可以在一定程度上预测Ⅱ～Ⅲ期结直肠癌患者的预后。

作为一种多功能蛋白，hnRNP A2/B1通过多种机制参与恶性肿瘤的发生和发展。研究表明，hnRNP A2/B1通过与癌基因和抑癌基因相互作用（如 k-Ras[8]和 p53[16]）来调节肿瘤细胞分化和发展。在肝癌细胞中，hnRNP A2/B1蛋白能够激活snail的转录，从而抑制snail的关键靶基因E-cadherin的转录，使E-cadherin表达减少，导致上皮—间质转化[17]。在宫颈癌中，hnRNP A2/B1蛋白可通过PI3K/Akt通路来调节细胞周期，抑制细胞凋亡[18]，也可通过影响Ras-MAPK-ERK 通路 起作 用[19]。 结直 肠癌 中 ，hnRNP A2B1与长链非编码RNA相互作用，上调Zeb1表达，促进结肠癌发展[20]；其与TRA2B启动子相互作用，可促进TRA2B mRNA在人结肠癌细胞中的转录[21]。上述研究结果提示，hnRNP A2/B1作为调控mRNA可变剪切的重要分子，可通过影响许多上游通路的功能，参与肿瘤的发生发展，有望作为肿瘤治疗靶点之一。本研究结果显示，结直肠癌组织中hnRNP A2/B1蛋白呈高表达，hnRNP A2/B1蛋白高表达与结肠癌患者预后不良有关。hnRNP A2/B1可作为预测结直肠患者的预后指标，为临床工作提供参考。未来可以进一步研究hnRNP A2/B1参与结直肠癌发生发展的相关信号通路和潜在机制。