人脑胶质瘤组织双色荧光染色图像质量与诊断效能分析

王凯旋，李鹏飞，赵宇，李航，李明，张世渊，吉宏明，胡昌辰，

1山西医科大学第五临床医学院，太原 030001；2山西省人民医院神经外科

胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤，WHO将脑胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，Ⅰ、Ⅱ级为低级别脑胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别脑胶质瘤。胶质瘤的首选治疗方案为最大范围地安全切除肿瘤[1]。术中指导技术有助于临床医生更准确地识别正常脑组织与肿瘤的界限，以确定手术切缘。目前用于术中指导的神经导航、术中MRI、术中冰冻切片等各有优缺点，虽然能提高手术切除范围，但存在如术中脑漂移造成导航不准、术中MRI增加手术时间、切片组织结构模糊影响病理结果判断等问题。BODIPY493/503是一种细胞渗透性亲脂荧光染料，可对细胞中的脂质进行染色，呈现绿色荧光。DRAQ5是一种红色荧光染料，仅与DNA结合，是细胞核荧光染色的特异性染料。激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）可以清楚地显示细胞中的荧光[2]，图像分辨率和清晰度高[3]，具有对大样本进行拼接成像、荧光成像质量高等优势，可以进行双色荧光染色。2020年8月—2022年1月，我们探索了一种术中新鲜组织双色荧光染色技术，使用BODIPY493/503与DRAQ5分别染色脂质与DNA，运用LSCM进行双色荧光成像，并与“金标准”HE染色进行对比，以期能够快速、准确地识别正常脑组织与胶质瘤的界限，帮助神经外科医师判断手术切缘。

1 材料与方法

1.1 组织标本与实验材料 选择2020年8月—2021年8月山西省人民医院收治的脑胶质瘤患者的术中组织标本71例，均经组织病理检查确诊。纳入标准：①术前本院影像检查提示脑胶质瘤可能；②术后病理诊断为脑胶质瘤；③初诊，入院前未接受任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料完整。将每一份样本分成2块组织标本，分别用于双色荧光染色和HE染色。分别于染色后及染色90 d后由两名病理科医生对双色荧光染色和HE染色组织图像进行评估。所有研究对象或其家属知情同意并签署知情同意书，本研究经山西省人民医院医学伦理委员会审核批准（批号2019省医科伦审字第85号）。BODIPY493/503（Invitrogen公司），DRAQ5（Thermofisher公司），OCT组织包埋剂，中性甲醛，苏木精染液，1%盐酸乙醇，1%醇溶性伊红液。FV1000激光扫描共聚焦显微镜（日本Olympus公司，配备二维电动样品台），KF-PRO-005EX数字切片扫描仪（中国宁波江丰生物公司）。

1.2 双色荧光染色及图像采集 BODIPY493/503染色方法：①取一块1.0 cm×1.0 cm的组织标本，经OCT组织包埋剂包埋后于-12℃冷冻3 min，切取约10µm厚切片，贴附于洁净载玻片上；②BODIPY493/503粉剂用PBS配成10 mg/mL的原液，以1：500比例配成浓度20µg/mL的BODIPY493/503荧光试剂溶液；③丙酮固定10µm厚的脑组织切 片 30 min[4]；④ 用 PBS 冲 洗 3 次 后 滴 加BODIPY493/503荧光试剂[4]；⑤37 ℃温箱孵育 30 min后用PBS冲洗[4]。DRAQ5染色∶PBS冲洗后直接滴加DRAQ5染色剂[5]，在37 ℃温箱孵育1 h后反复PBS冲洗5 min，盖玻片封片。将双色荧光染色完成的标本置于FV1000激光扫描共聚焦显微镜载物台上，进行双色荧光图像采集，同时于520、683 nm处采集到绿色和红色荧光图像，采集软件为FV10-ASW Viewer4.2，物镜放大倍率为20倍，数值孔径0.75，大部分标本分辨率设置为1024×1024像素，适当调整光电倍增管电压，其余为默认设置。

1.3 HE染色及图像采集 HE染色方法：取同一样本的另一块组织标本，切取约1.0 cm×1.0 cm的标本；标本浸于4%甲醛固定18～24 h；标本于梯度乙醇中处理12 h；二甲苯浸泡2～2.5 h；65℃石蜡浸泡3～4 h，自动包埋机包制；取约4µm厚的石蜡片贴于载玻片上；常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇清洗至水化；苏木精染液浸染10～15 min、水洗；1%盐酸乙醇分化3 s、水洗、饱和碳酸锂蓝化5～10 s，流水冲洗15～30 min；1%醇溶性伊红浸染5～15 s；常规脱水、透明、封片。将HE染色的切片于KF-PRO-005EX数字切片扫描仪（图像采集软件为K-Viewer V1）采集图像，由病理科医生进行评估。

1.4 组织染色图像质量评价 组织样本的双色荧光染色与HE染色图像采集完成后，将双色荧光染色图像随机分给另外两名病理科医生对双色荧光染色图像与HE染色图像进行对比评估，并进行WHO分级。细胞核DNA深染且具有核异常分裂象（细胞核增大、形态不规则等）的为星形细胞瘤，如无微血管增生及坏死等高级别胶质瘤的特征，则为星形胶质细胞瘤（WHO Ⅱ级）；若细胞密度增多，有丝分裂旺盛，则为间变性星形细胞瘤（WHO Ⅲ级）。胶质母细胞瘤（WHO Ⅳ级）典型表现为微血管增生及坏死，后者常表现为胶质母细胞瘤DNA周围的栅栏状坏死。少突胶质细胞瘤（WHO Ⅱ级）细胞核均匀大小，呈圆形；间变性少突胶质细胞瘤（WHO Ⅲ级）的特征是核DNA分裂频繁，异常分裂象，伴微血管增生或坏死。室管膜瘤（WHO Ⅱ级）细胞核较小，DNA染色较淡，细胞密度较低，典型表现为细胞在血管周围花环状排列；间变性室管膜瘤（WHO Ⅲ级）细胞数多，核DNA分裂象多，有微血管增生或栅栏状坏死。

1.5 统计学分析 采用SPSS26.0统计软件。以Cohen's κ统计量衡量双色荧光染色与HE染色诊断的一致性。κ范围为-1～1，κ＞0表示观察一致性大于偶然一致性，κ＝0表示完全偶然，κ＜0表示观察一致性小于偶然一致性。κ＜0.40表示一致性较差，0.40≤κ＜0.75表示一致性基本满意，κ≥0.75表示一致性相当满意[6]。计算两位病理医生的诊断准确率、敏感度、特异度。

2 结果

2.1 双色荧光染色图像与HE染色图像对比 双色荧光染色的细胞核被DRAQ5荧光试剂染成红色[7]，BODIPY493/503将脂质染成绿色[8]，增加了细胞核与脂质的对比。双色荧光染色的图像背景清晰，细胞核与脂质对比鲜明，组织结构基本完整，可用于诊断胶质瘤。双色荧光染色图像与HE染色图像对比，整体组织轮廓相似，但部分存在荧光淬灭现象，使得组织标本显得不完整；双色荧光图像放大后可见胶质瘤细胞核增大，形态不规则，有的细胞核拉长；高级别胶质瘤可见肿瘤细胞周围核栅栏状坏死，绿色荧光强。低级别胶质瘤的双色荧光图像可见细胞核数量增多，同样具有核不典型性。高级别胶质瘤与低级别胶质瘤的双色荧光染色图像都可见较强烈的绿色荧光，高级别胶质瘤更明显。双色荧光染色完整保留了脂质，HE染色则去除了细胞中的脂质，无法获取与胶质瘤相关的脂质信息。见图1、图2。

图1 人脑胶质瘤组织双色荧光染色与HE染色大体图像对比

图2 人脑胶质瘤组织双色荧光染色与HE染色细胞核图像对比

2.2 双色荧光染色与HE染色诊断的一致性 病理科医生A评估双色荧光染色图像得到低级别胶质瘤21例、高级别胶质瘤50例，病理科医生B分别为24、47例。有4例HE染色证实WHO Ⅱ级的星形细胞瘤被诊断为间变性星形细胞瘤（WHO Ⅲ级），2位病理医生均错误判断；病理科医生A将5例少突胶质细胞瘤（WHO Ⅱ级）错误判断为间变性少突胶质细胞瘤（WHO Ⅲ级），3例室管膜瘤（WHO Ⅱ级）诊断为间变性室管膜瘤（WHO Ⅲ级）；病理医生B将2例间变少突胶质细胞瘤诊断为少突胶质细胞瘤，2例间变性室管膜瘤（WHO Ⅲ级）诊断为室管膜瘤（WHO Ⅱ级）。将病理科医生A、B的诊断结果与HE染色的诊断结果进行Kappa一致性检验，κ值分别为0.48、0.64。染色90 d后，两位病理科医生第二次评估双色荧光染色图像，病理科医生A诊断低级别胶质瘤26例、高级别胶质瘤45例，病理科医生B分别为28、43例。将病理科医生A、B第二次诊断结果与HE染色诊断结果进行Kappa一致性检验，κ值分别为0.76、0.82。病理科医生A第一次诊断敏感度为88%、特异度为57%、诊断准确率为76%，第二次诊断分别为93%、82%、89%；病理科医生B第一次诊断敏感度为91%、特异度为71%、诊断准确率为83%，第二次诊断分别为93%、89%、92%。见表1、表2。

表1 两位病理科医生第一次评估双色荧光染色诊断结果与HE染色诊断结果比较（例）

表2 两位病理科医生第二次评估双色荧光染色诊断结果与HE染色诊断结果比较（例）

3 讨论

脑胶质瘤是指起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤。我国脑胶质瘤的年发病率为（5～8）/10万，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌。在治疗方面，目前采用以最大范围安全切除为主，术后放疗、化疗为辅的综合治疗方案[1]。胶质瘤极易复发，即使采取积极的治疗措施，预后仍差。根据中国胶质瘤基因组图谱统计[9]，低级别胶质瘤患者中位总生存期（OS）为78.1个月，间变性胶质瘤为37.6个月，胶质母细胞瘤（GBM）患者OS为14.4个月。低级别胶质瘤的6个月及1、3、5年OS率分别为99%、94%、79%、67%，间变性胶质瘤分别为 88%、75%、51%、36%，GBM为87%、61%、15%、9%。

神经外科医生在技术上面临的挑战是区分胶质瘤与正常脑组织的界限，手术指导技术的进步提高了医生对胶质瘤与正常脑组织界限的视觉辨别能力[10]。目前用于手术指导的技术主要包括基于MRI成像的神经导航系统、活体荧光染色成像、术中MRI及术中超声、术中病理分析等。神经导航系统具有手术切口小的优点，但由于导航是基于术前MRI的，病情的进展可能导致脑漂移从而使导航不准确[10]。活体荧光染色成像可选择的药物有5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）、荧光素、吲哚菁绿[10]（ICG），但是，荧光素与ICG除在浸润性胶质瘤与正常脑组织边界聚集，也常在血脑屏障破坏处累积，5-ALA也有假阳性与假阴性的报道[11]。术中MRI及术中超声对手术室的基础设施有着更高的要求。有报道称，术中MRI使手术时间增加约1 h，麻醉时间延长，增加了潜在的术中风险[12]。术中进行实时病理检查，有助于手术医生即时评估手术切缘范围，制定精确的手术策略，从而最大范围切除肿瘤，常用的方法为术中冰冻切片。但是，由于脑组织富含水分，易形成冰晶[13]，造成组织结构模糊，辨识难度大，影响病理诊断结果的准确性。双色荧光染色与术中冰冻切片相比，图像组织结构清晰，诊断准确率高，应用前景大。

传统HE染色的细胞核与细胞质的蓝红对比，在双色荧光染色图像中转变成DNA与脂质的红绿对比。高级别胶质瘤的双色荧光染色图像可见绿色荧光强，提示与脂质代谢有关，而在低级别胶质瘤中可见绿色荧光相比高级别胶质瘤弱且范围小，提示可能与脂质代谢不如高级别胶质瘤活跃有关。对比高级别胶质瘤与低级别胶质瘤的双色荧光染色图像，都可见较强烈的绿色荧光，高级别胶质瘤更为明显，提示脂质代谢与胶质瘤分级密切相关。不同于术中冰冻及HE染色，双色荧光染色没有脱脂步骤，完整保留了脑组织的脂质，可以对新鲜脑组织的脂质代谢进一步研究。脂质代谢改变是恶性肿瘤最突出的代谢改变之一。脂质不仅是机体重要的能源物质，也是前列腺素、白三烯等不饱和脂肪酸衍生物的前体物质，在机体炎症反应、凝血及血栓形成等重要过程中不可或缺[14]。脂质参与构成生物膜的重要成分，还是体内重要的信号分子。胶质瘤中脂质代谢相关酶和蛋白，如单酰基甘油酯脂肪酶能通过调节PGE2/pLRP6/β-catenin信号通路来诱导肿瘤相关巨噬细胞向M2极化，增强GBM的侵袭性[15]；脂肪酸结合蛋白7与其配体结合使得ATP-柠檬酸裂解酶磷酸化和激活，ATP-柠檬酸裂解酶促进乙酰CoA生成，使得胶质瘤获得增殖所需的能量和物质[16]；SREBP-2基因促进胆固醇合成并增加细胞外胆固醇的摄取，并促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为[17-18]。脂质代谢与胶质瘤发生发展密切相关，研究脂质代谢对于胶质瘤治疗药物的开发有着重要意义。

本研究结果显示，人脑胶质瘤组织的双色荧光染色图像具有类似HE染色的组织学特点，且能够完整保留脂质，同时与HE染色相比，诊断一致性基本满意，诊断准确率、敏感度及特异度高。这表明可以通过双色荧光染色图像来进行病理组织学检查，可以用于术中实时评估手术切缘，有助于医生制定手术策略。双色荧光染色图像对于病理科医生来说容易理解，学习曲线短。有研究表明，与HE染色相比，LSCM诊断的前列腺癌的准确率为91%，ROC曲线下面积为0.884，灵敏度和特异度分别为83.33%、93.53%[19]，认为LSCM具有较好的应用前景，可以将其作为快速检查前列腺组织的工具。

综上所述，我们认为，双色荧光染色在胶质瘤病理诊断中具有较好的应用前景，可辅助手术医生更好地制订手术策略，提高胶质瘤的全切除率及次全切除率，改善患者预后。同时，研究脂质代谢有助于探索胶质瘤发生、发展、耐药等机制，双色荧光染色相对于完全去除了脂质的HE染色来说，脂质信息保存完整，可以进一步进行脂质代谢相关研究。但双色荧光染色尚存在荧光淬灭、染色时间长等问题，仍需进一步优化技术，以期早日应用于临床。