北京市结防机构2019年非结核分枝杆菌临床分离株危险因素及耐药情况分析

杨新宇 赵琰枫 易俊莉 陈昊 陈双双 代小伟 丁北川 孙闪华 李传友

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。由非结核分枝杆菌引起的疾病称为非结核分枝杆菌病。目前，已报道的分枝杆菌菌种数量超过190种，但其中只有少部分为条件致病菌[1-2]。

近年来，随着结核病的控制取得长足进步，非结核分枝杆菌的问题越来越突出，非结核分枝杆菌病呈现快速增长的趋势，我国结核病流行病学调查结果显示，2010年NTM分离率为22.9%[3]，远远高于1990年(4.9%)和2000年(11.1%)。NTM主要引起肺部和皮肤的病变，临床表现与结核引起的感染十分相似，如果没有及时进行菌型鉴定，极容易与结核感染相混淆，被误认为为耐药结核而延误病情。为了解北京市NTM流行情况，笔者收集2019年北京市各级结防系统NTM临床分离株进行菌种及药敏鉴定，为科学制定北京市NTM诊疗策略提供依据。

资料与方法

一、 研究对象和实验材料

1 研究对象 本研究使用的临床分离株均由北京市疾病预防控制中心提供，标本来源于2019年1月1日至12月31日期间北京市14家结防机构(北京结核病控制研究所、昌平区结核病防治所、朝阳区疾病预防控制中心结防所、大兴区结核病预防控制中心、东城区疾病预防控制中心结核病防制科、房山区疾病预防控制中心结防所、怀柔区疾病预防控制中心结防科、密云区结核病防治所、平谷区结核病预防控制中心、石景山区疾病预防控制中心结防所、顺义区结核病防治中心、通州区疾病预防控制中心结防所、西城区疾病预防控制中心结防所、延庆区疾病预防控制中心结防所)和6家定点医院[丰台区中西医结合医院、丰台区铁营医院、中国航天科工集团731医院(丰台区)、航天总医院(丰台区)、北京老年医院(海淀区)、北京京煤集团总医院(门头沟区)]分离出的NTM菌株，数据涵盖北京地区的全部结防机构(丰台区、海淀区、门头沟区结核病的临床诊疗工作由各区定点医院承担)。

本项目研究资料源于本市16个区县及市结防系统所有分枝杆菌培养阳性临床分离菌株，所有区县及市结防机构阳性菌株均交由北京结核病控制研究所中心实验室保存，研究已通过北京结核病控制研究所伦理委员会的审批(伦理批号：202005)。

2 仪器与试剂

(1)分枝杆菌中性罗氏培养基、初步菌种鉴定培养基[对硝基苯甲酸(PNB)500μg/mL]以及比例法所需药敏培养基(异烟肼(INH)0.2 μg/mL，利福平(RFP)40 μg/mL,链霉素(Sm)4 μg/mL，乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL，左氧氟沙星(Lfx)2 μg/mL，阿米卡星(Am)30 μg/mL，卷曲霉素(Cm)40 μg/mL，丙硫异烟胺(Pto)40 μg/mL，对氨基水杨酸(PAS)1 μg/mL)均由河南赛诺特生物技术有限公司提供。

(2)分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(PCR-荧光探针法)、杂交仪、芯片洗片机、扫描仪均由成都博奥晶典生物科技有限公司提供，扩增所需PCR仪由杭州博日科技有限公司提供。

(3)分枝杆菌菌种鉴定基因测序送至北京六合华大基因科技有限公司。

二、实验方法

1 分枝杆菌菌种鉴定及初步菌群鉴定 实验方法采用实验室非结核分枝杆菌筛查推荐流程[4]，采用表型法进行初步菌群鉴定，确定为非结核分枝杆菌者采用分子生物学中基因芯片的方法进行菌种鉴定，初步菌群鉴定与基因芯片方法不一致的菌株，采用测序的方法进行最终鉴定。每名患者只检测一次，同一年份多次冻存的患者菌株按第一次统计。

(1)菌群检测(表型法)：所有菌株鉴定均按照《结核病实验室检验规程》[5]，使用含PNB罗氏培养管鉴定区分该菌株属于结核分枝杆菌群(MBC)和非结核分枝杆菌群(NTM)。取初生长4周的分枝杆菌菌株，使用生理盐水制备成麦氏标准浊度为1mg/mL的菌悬液,经稀释后将终浓度为10-1mg/mL的菌悬液0.1mL接种到含PNB罗氏培养管及对照管(普通罗氏培养基)中，37℃恒温培养4周，如对照管中分枝杆菌生长良好，则报告菌群初步鉴定实验结果；如果在对照管中没有生长，则需重新进行实验。PNB阴性定为MBC；PNB阳性定为NTM。

(2)菌种检测(分子生物学法):① 微阵列基因芯片：将PCR产物置于PCR仪中95℃变性5 min，随后立即置于冰水混合物中骤冷冰浴3 min；按鉴定试剂盒操作说明书吸取14微升，杂交混合物经加样孔加入芯片点阵中，50℃ 5rpm杂交2h，用SDS、SSC洗液冲洗干净，甩干后放入芯片扫描仪用专用软件判读芯片结果。②基因测序：两种方法检测结果不同的菌株，经传代分离纯化后提取核酸送至北京六合华大基因科技有限公司，对16SrRNA基因测序，测序结果进行 NCBI-BLAST 比对，NCBI 链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

2 药物敏感性检测 按照《结核病实验室检验规程》[5]采用1%比例法对培养阳性的NTM临床分离株进行抗结核药物的药敏试验。药物包括四种一线抗结核药物和四种二线抗结核药物：异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、左氧氟沙星(LFX)、阿米卡星(AK)、卷曲霉素(CPM)、对氨基水杨酸(PAS)；若耐药比例≥1%，则判断为受试菌对该抗结核药耐药(耐药百分比=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数×100%)。

3 质量控制

(1)菌种鉴定质量控制：①每批菌种鉴定均采用试剂盒自带阳性对照及阴性对照质控品检测微阵列基因芯片菌种鉴定结果。②菌群鉴定每年参加国家疾病预防控制中心结核病参比实验室的室间质评，考核成绩均为优秀。

(2)药敏试验质量控制：①每批试验以结核分枝杆菌标准株H37Rv 10-3mg检测含药培养基质量。②若高稀释度菌液(10-4mg/mL)在对照培养基上生长的菌落数少于20个，则重复试验。③比例法药敏试验每年参加国家疾病预防控制中心结核病参比实验室的室间质评，考核成绩均为优秀。

三、数据统计分析方法

应用SPSS19.0软件对数据进行整理和统计分析，对NTM组与结核分枝杆菌(TB)组的暴露因素进行单因素分析，计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，并将单因素分析中所有影响因素纳入多因素logistic回归分析模型进行分析，计算对应的OR值(95%CI)。P<0.05时判断为差异有统计学意义。

结 果

一、非结核分枝杆菌分离率及菌种分布

2019年分枝杆菌培养阳性菌株1254株，通过PNB鉴别培养基生长实验检出NTM85株，经微阵列基因芯片检测技术进行菌种检测共鉴定出非结核分枝杆菌81株(其中1株为“无法判读”)，4株为结核分枝杆菌;“无法判读”菌株经基因测序检测技术鉴定为慢黄分枝杆菌，4株不一致菌株经基因测序检测技术鉴定2株为结核分枝杆菌，1株为测序杂合，1株为盐单胞菌，共检出NTM81株，NTM分离率为6.5%(81/1254，95%CI：0.051～0.078)，缓慢生长型占59.26%，快速生长型占40.74%。检出率前四位的NTM分别为：胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌。81株NTM分布情况如下(见表1)。

表1 2019年非结核分枝杆菌菌种分布

二、2019年非结核分枝杆菌流行病学资料及危险因素分析

以分离出非结核分枝杆菌的菌株为因变量，单因素回归分析中(见表2)，与分离出TB组相比，差异有统计学意义的指标：治疗史(初治=0，复治=1)、年龄(计量资料)以及报告区县(城区=0，郊区=1)采用logistic回归方程分析非结核分枝杆菌菌株流行病学资料的高危因素，结果发现：复治病人、报告区县为城区将增加对于NTM分离的风险，年龄越大分离出NTM的风险越高(见表3)；从(图1)可见NTM临床分离比例较多的区县主要集中在城区。

表2 2019年NTM组和TB组暴露因素的单因素比较[n(%)]

表3 2019年非结核分枝杆菌临床分离株的多因素logistic回归分析

图1 81例NTM临床分离株分离率在16个区县的分段设色图

三、 NTM临床分离株不同类型菌种在常用抗结核药物中的耐药情况

经表型法进行初步菌群鉴定，分子生物学方法进行菌种鉴定后，分离出的81株NTM菌株用比例法对八种抗结核药物(INH、RFP、SM、EMB、LFX、AK、CPM、PAS)进行药敏试验，81例NTM对上述八种药物的耐药率分别为97.53%、66.67%、91.36%、77.78%、61.73%、69.14%、74.07%、97.53%；其中对于异烟肼和对氨基水杨酸的耐药率为最高；胞内分枝杆菌、鸟分枝分枝杆菌、脓肿分枝杆菌以及偶然分枝杆菌对于四种一线抗结核药物均表现出较高的耐药率，堪萨斯分枝杆菌对于INH、SM以及PAS表现出较高的耐药率(表4)。

表4 NTM临床分离株不同菌种对常用药物的耐药率

讨 论

随着非结核分枝杆菌病的增多，NTM病已成为常见病[6]。由于NTM病临床症状的不典型、影像学表现与结核分枝杆菌差异不大，容易造成误诊和漏诊，又因其对传统抗结核药物耐药性较高，如果使用抗结核药品治疗，不但效果不理想[7]，而且容易误诊为耐多药结核病，给临床诊断和治疗带来很大困扰，因此要重视分枝杆菌的菌种鉴定以及患者流行病学史的调查。目前，NTM的诊断仍以实验室检测结果作为诊断标准，本文NTM分离鉴定流程采用实验室非结核分枝杆菌筛查推荐流程[4]，保障了结果的准确。

一、NTM分离率及菌种分布

近年来非结核分枝杆菌病呈现快速增长趋势，引起了广泛的关注。美国NTM肺病的发病率从2008年的3.13/10万上升到2015年的4.73/10万[8]。韩国NTM病的发病率从2008年的6.0/10万上升到2016的19/10万[9]，本次调查结果显示，2019年北京16个区县结防系统所提供的分枝杆菌临床分离株中NTM分离率为6.5%，与北京地区此前报道的2009年的3.1%[10]相比有了显著升高；从菌种分布看，本次研究鉴定出的81株NTM中涵盖了9种菌种，排名前四位的分别为胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和偶然分枝杆菌，此前报道的2009、2013年北京地区130株NTM鉴定结果为胞内分枝杆菌的分离率最高(39.2%)，其次为堪萨斯分枝杆菌(37.7)、鸟分枝杆菌(6.9%)、脓肿分枝杆菌(5.4%)和偶然分枝杆菌(3.0%)[11]，本次结果与以往结果相比，缓慢生长型比例虽然仍然高于快速生长型，但是从比例分配上来讲，快速生长型NTM的比例有了显著升高，说明北京地区从以胞内分枝杆菌为主，缓慢生长型占明显优势的格局已经发生改变，其中增长最快的NTM为脓肿分枝杆菌，以往多认为NTM为机会致病菌，水和土壤是它的重要传播途径，近年来通过对脓肿分枝杆菌进行全基因组测序后，发现一些肺纤维化患者感染的脓肿分枝杆菌菌株之间存在高度同源性，说明脓肿分枝杆菌可能存在人传人的可能，应引起高度关注[12]。

二、危险因素分析

通过对2019年NTM分离株流行病学资料的危险因素进行分析发现，治疗史、报告区县和年龄对于NTM的发生影响较大，本研究显示NTM可以发生在各个年龄阶段，且随着年龄的增长而增加，一般认为有肺部基础疾病的人群更容易感染NTM[1]，随着年龄的增长发生各种肺部疾病的概率会大幅度提高，从而更容易引起NTM的发生；从治疗史上看，复治病人更容易引起NTM的发生，分析认为NTM在临床诊疗过程中容易误诊为TB，且对常规抗结核药物表现出不同程度的耐药，治疗效果多不理想，因而更不容易完全治愈；从地域分布上看，北京市的中东部地区NTM分离率明显高于其他地区，中部地区为北京市的中心城区，与郊区相比人员密度更大，人口数量更多，随着NTM病的增多，对于高危险地区更应引起关注，但目前区县级的结防机构缺乏NTM的诊断手段，应加速区县级防治所检测的普及力度，提高医务人员诊断意识，在NTM高发地区加强检测。

三、NTM的药物敏感性

多数NTM对于抗结核药物耐药，本次研究结果显示81株NTM对一线、二线抗结核均有较高的耐药性，特别是对一线抗结核药物耐药性更高，这与秦中华等报道的天津地区339株临床分离株报道的耐药情况基本一致[13]。NTM的药物敏感性试验目前没有比较明确的推荐方法，虽然美国临床与实验室标准化研究所(CLSI)对于某些NTM菌种有推荐的药物及临界浓度，但这些方法仍有待临床进行评判[14]，大多数体外药敏结果与临床疗效的关系尚不明确[1]。尽管如此，NTM在治疗前仍需要进行菌种鉴定，根据已经明确的相关性，进行个性化化疗方案治疗。另外，在临床诊疗过程中，应重视NTM与耐药以及耐多药结核病的鉴别诊断，对于久治不愈的耐药结核病患者应及时进行菌种鉴定，防止病人漏诊、误诊。

综上所述，北京地区NTM分离率有显著增高，随着快速生长型NTM所占比例的增高，NTM菌种分布由缓慢生长型占绝对优势的格局已发生转变；北京NTM分离率随年龄的增长而增加，人口密集地区分离率较高；鉴于NTM对于绝大多数抗结核药物都耐药，临床应注意与耐药结核病的鉴别诊断，对于耐多药以及广泛耐药的结核病患者，应及时进行分枝杆菌菌种鉴定。