外源5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗生长的缓解效应及抗氧化酶基因表达的影响

王 鹏，杨奥军，冯志进，王 婷，金梓浩，王 芳，彭云玲

(甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070)

玉米(ZeamaysL.)是我国重要的粮饲兼用作物，其中北方春播玉米作为我国玉米生产的重要组成部分，对我国玉米总产量有着突出贡献。干旱是玉米丰产的重要制约因素，而北方春季降雨量少，水汽蒸发速率高，导致干旱对北方春播玉米造成了极其恶劣的影响[1]。尤其是玉米苗期，对水分的敏感程度较大，一旦遭受干旱胁迫，幼苗的生长就会受到严重影响，并导致幼苗在生理生化和代谢方面发生一系列变化。研究表明，外源植物生长调节剂(Plant growth regulator，PGR)具有缓解生物、非生物胁迫对植物造成伤害的作用，可通过调控植物体内多个生理生化进程直接或间接地提高植物的抗性，因此，探索潜在的生长调节物质及其调控机理对提高植物抗逆性具有非常重要的意义[2]。

5-ALA是四氢吡咯的前缀化合物，是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等必不可少的物质，是一种潜在的生理活性物质[3]，现已证实其对干旱、盐、高温、低温、重金属和紫外辐射等多种非生物胁迫具有一定的缓解效应[4]。Watanabe等[5]研究发现5-ALA能够促进高盐分条件下棉花植株的生长；Balestrasse等[6]和Wang等[7]研究发现外源5-ALA能够提高低温胁迫下大豆幼苗弱光和低温胁迫下甜瓜幼苗中的叶绿素含量；张春平等[8]研究发现使用100 mg·L-1的5-ALA处理遭受干旱胁迫的草珊瑚，不仅叶片中叶绿素含量显著提高，叶绿素荧光参数也有所提高。5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗生长的缓解效应及其相关抗氧化酶基因表达的研究鲜有报道，因此，本试验在15%PEG-6000处理模拟的干旱胁迫下，研究喷施外源5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗生长、活性氧代谢、叶绿素含量、光合能力及抗氧化酶基因表达的影响，明确5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗生长的调节作用，为5-ALA调控玉米幼苗的抗旱机理的研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗旱玉米自交系郑58和干旱敏感自交系TS141。

1.2 试验方法

挑选饱满、大小一致的玉米种子，用1%的NaClO溶液消毒10 min，使用蒸馏水冲洗多次，直到NaClO溶液味道消失为止，浸种24 h。在每个装满蛭石的塑料花盆(长×宽×高：15 cm×13 cm×11 cm)中分别播种10粒种子，放入人工智能气候培养箱内进行培养，其培养条件为光照14 h，黑暗10 h，温度为25℃/20℃，光照强度为500 μmol·m-2·s-1，相对湿度为60%。每隔2 d使用1/5浓度的Hoagland营养液浇灌1次。待玉米幼苗生长至三叶一心期进行试验处理。CK，正常浇水+叶片喷施蒸馏水；ALA，正常浇水+叶片喷施5-ALA；PEG,干旱胁迫+叶片喷施蒸馏水；AP,干旱胁迫+叶片喷施5-ALA。

根据前期的试验结果，本试验中选用15% PEG-6000模拟干旱胁迫，5-ALA喷施浓度选用25 mg·L-1。CK和PEG处理组玉米叶片喷施蒸馏水，ALA和AP处理组玉米叶片喷施5-ALA，连续处理3 d，同时PEG和AP处理组每隔2 d使用100 mL 15% PEG-6000的Hoagland营养液浇灌进行干旱胁迫处理，CK和ALA处理组每隔2 d使用等量的1/5浓度的Hoagland营养液浇灌处理。试验每个处理重复3次。胁迫处理1周后取样，液氮处理后-70℃保存，用于生理指标和基因表达量的测定。

1.3 试验指标及测定方法

1.3.1 玉米幼苗生长指标的测定 苗长的测定：第8天每个处理选取10株幼苗用直尺测量幼苗茎基部至顶端生长点的长度。幼苗鲜、干重的测定：每个处理选取10株幼苗，用蒸馏水冲洗干净，并用滤纸吸干表面残余水分，称量鲜重，随后将其置于烘箱内，105℃杀青30 min，80℃烘干至恒重后称量其干重。

1.3.2 玉米幼苗生理指标的测定 H2O2含量采用分光光度法测定[9]，MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法测定[9]，SOD活性采用光化学还原法测定[10]，POD活性采用愈创木酚比色法测定[10]，CAT活性采用紫外吸收法测定[10]，APX活性采用比色法测定[10]。

1.3.3 玉米幼苗叶绿素含量的测定 使用便携式叶绿素测定仪测定。

1.3.4 玉米幼苗气体交换参数测定 测定之前将玉米植株在自然光照条件下进行光适应至少10 min，使用LI-6400便携式光合仪测定叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和胞间CO2浓度(Ci)。

1.3.5 玉米幼苗叶片上表皮气孔观察 参照Yu等[11]叶片表面压印法，选取不同处理下玉米幼苗第三片功能叶中间部位(1 cm×1 cm)，制作叶片上表皮切片，每个处理3个重复，然后置于LEICA DM 500光显微镜，在10×10倍镜下观察气孔形态，并随机选取6个视野拍照，然后利用Image-Pro Plus 6.0软件统计单位面积气孔数量，并测量气孔宽度和长度。

1.3.6 抗氧化酶基因表达分析

(1)荧光定量特异性引物设计。以Actin基因为内参基因，采用实时定量PCR技术，检测3种抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1的mRNA水平。引物由上海生工有限公司合成,各目的基因引物序列见表1。

表1 抗氧化酶基因和内参基因的引物序列Table 1 Primer sequences of antioxidant enzyme gene and internal reference gene

(2)总RNA的提取及反转录。总RNA的提取：按照Steady Pure植物RNA提取试剂盒(艾科瑞，AG)说明书提取，使用BioBnMATEr5超微量紫外分光光度计测定浓度和纯度，并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。

按照Evo M-MLV反转录试剂预混液(艾科瑞，AG)说明书进行反转录，在无菌无酶的离心管中加入4 μL的5×Evo M-MLVRT Master Mix，RNA的量根据提取的浓度稀释后加入，添加RNase free water至20 μL的体系，混匀、离心。按照第一阶段37℃ 15 min，第二阶段85℃ 5 s，4℃保存的反应条件进行反转录，得到单链cDNA 于-20℃保存备用。

(3)荧光定量PCR(Real-Time PCR)。Real-Time PCR采用2×SYBR Mixture(Biomiga)荧光定量试剂盒。采用Step One Plus实时PCR系统(Applied bio-systems, CA, 美国)进行荧光定量PCR扩增，反应体系见表2。反应条件：95℃预变性30 s， 95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，循环40次，每个样品3次重复。

表2 qPCR反应体系Table 2 qPCR reaction system

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0对所得数据进行统计和多重比较分析。基因的表达量采用2-ΔΔCT相对定量的方法，对不同处理玉米叶片抗氧化酶基因表达量进行数据分析。各指标试验数据均采用3次重复。

2 结果与分析

2.1 外源5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗苗长、鲜重及干重的影响

由表3可知，喷施5-ALA后，自交系郑58的苗长、幼苗鲜重、幼苗干重与对照(CK)差异不显著，而TS141与对照相比，苗长没有显著差异，幼苗干鲜重却有显著差异。在PEG处理下，与对照(CK)相比，郑58和TS141玉米幼苗的苗长、鲜重、干重都显著降低，郑58分别下降18.49%、29.06%和20.00%， TS141分别下降25.66%、23.97%和13.64%；与PEG处理相比，AP处理下的郑58和TS141幼苗的苗长、鲜重和干重都有增加，苗长分别增加了13.31%和11.21%，幼苗鲜重分别增加了22.29%和18.23%，幼苗干重分别增加了16.67%和10.53%。表明喷施5-ALA能够有效缓解干旱胁迫对玉米幼苗苗长、鲜重和干重的抑制作用。

表3 不同处理下玉米幼苗苗长、鲜重及干重Table 3 Seedling length, fresh weight and dry weight of maize seedlings under different treatments

2.2 外源5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗丙二醛和H2O2含量的影响

由图1可知，与对照(CK)相比，ALA处理下郑58幼苗叶片的MDA及H2O2含量变化不显著，TS141幼苗叶片中MDA及H2O2含量呈下降趋势；PEG处理下，与对照相比，郑58和TS141幼苗叶片中MDA及H2O2含量都显著提高，MDA含量分别提高了164.58%、263.53%，H2O2分别提高了134.95%、203.83%。干旱胁迫下喷施5-ALA后(AP处理)，与PEG处理相比，郑58和TS141幼苗叶片中MDA及H2O2含量显著降低，MDA分别降低了17.85%、25.39%，H2O2分别降低了23.26%、19.15%。说明5-ALA能显著抑制干旱胁迫下玉米幼苗叶片中MDA及H2O2含量的提高，减缓活性氧的积累。

图1 外源5-ALA对干旱胁迫下两个玉米自交系丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量的影响Fig.1 Effect of exogenous 5-ALA on MDA and H2O2 content of two maize inbred lines under drought stress

2.3 外源5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影响

由图2以看出，与对照(CK)相比，ALA处理下郑58和TS141玉米幼苗叶片中的SOD、POD、CAT和APX活性变化不显著。PEG处理下幼苗叶片中的4种酶活性都显著升高，与对照相比，郑58分别提高了65.61%、29.48%、68.49%、141.51%，TS141分别提高了63.01%、48.00%、85.68%、204.29%。与PEG处理相比，AP处理下的幼苗叶片中的4种酶活性显著增加，郑58分别增加16.49%、18.15%、36.98%和28.13%，TS141分别增加16.65%、16.54%、28.49%和26.76%。这说明喷施5-ALA能够提高玉米幼苗叶片中抗氧化酶的活性，缓解玉米的干旱胁迫程度。

图2 外源5-ALA对干旱胁迫下两个玉米自交系抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effect of exogenous 5-ALA on antioxidant enzyme activity of two maize inbred lines under drought stress

2.4 外源5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗叶绿素含量的影响

由图3可知，与对照(CK)相比，在ALA处理下，郑58和TS141玉米幼苗叶片中叶绿素含量均显著增加；PEG处理下，郑58玉米叶片中叶绿素含量比对照降低了33.46%，TS141比对照降低了42.26%；与PEG处理相比，AP处理下郑58玉米叶片叶绿素含量增加18.29%，TS141增加19.87%。说明喷施5-ALA能有效缓解干旱胁迫下玉米叶片中叶绿素含量的下降，并且对TS141的缓解效应更显著。

图3 外源5-ALA对干旱胁迫下两个玉米自交系叶绿素含量的影响Fig.3 Effect of exogenous 5-ALA on chlorophyll content of two maize inbred lines under drought stress

2.5 外源5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗光合特性的影响

由图4可以看出，PEG处理下，玉米幼苗叶片光合参数Pn、Gs、Tr明显降低，与CK相比，郑58的Pn、Gs、Tr分别下降48.78%、45.31%、52.39%，TS141的Pn、Gs、Tr分别下降57.66%、57.46%、65.14%；PEG处理下郑58的光合参数Ci与对照相比下降56.08%， TS141下降不显著；与PEG处理相比，喷施5-ALA的玉米幼苗叶片光合参数的下降得到了明显缓解，AP处理下郑58的Pn、Gs、Ci、Tr分别上升了35.87%、36.63%、51.21%、37.67%，TS141的Pn、Gs、Tr分别上升了42.12%、36.81%、67.88%，而TS141中的Ci与PEG处理相比下降23.79%。表明5-ALA能够提高干旱胁迫下玉米幼苗光合作用效率。

图4 外源5-ALA对干旱胁迫下两个玉米自交系光合特性的影响Fig.4 Effects of exogenous 5-ALA on photosynthetic characteristics of two maize inbred lines under drought stress

2.6 外源5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗叶片上表皮气孔的影响

从图5和图6可以看出，正常情况下，耐旱自交系郑58叶片上表皮单位面积气孔数量大于旱敏感自交系TS141，气孔长度和宽度郑58小于TS141。ALA处理下两个自交系叶片上表皮单位面积气孔数量、长度和宽度变化都不明显。PEG处理下两个玉米自交系叶片上表皮单位面积气孔数量显著增加，气孔长度和宽度均显著减小，耐旱自交系郑58叶片上表皮单位面积气孔数量与对照相比增加了39.64%，气孔长度和宽度分别减小了22.48%和26.39%，而旱敏感自交系TS141叶片上表皮单位面积气孔数量增加了28.72%，气孔长度和宽度分别减小了15.88%和23.08%，郑58叶片上表皮单位面积气孔数量的增幅、气孔长度和宽度的减幅都远大于TS141。喷施外源5-ALA后对干旱胁迫下气孔特性有明显的缓解效应，郑58叶片上表皮单位面积气孔数量与PEG处理相比减少12.90%，气孔长度和宽度分别增加16.04%和21.49%，而TS141叶片上表皮单位面积气孔数量与PEG处理相比减小16.53%，气孔长度和气孔宽度分别增大了11.19%和11.97%。

图5 不同处理下两个玉米自交系幼苗叶片上表皮气孔显微结构Fig.5 Stomatal microstructure of upper epidermis of two maize inbred lines seedlings under different treatments

图6 不同处理对两个玉米自交系幼苗叶片上表皮气孔参数的影响Fig.6 Effects of different treatments on stomate of seedling leaves of two maize inbred lines

2.7 外源5-ALA对干旱胁迫下玉米幼苗抗氧化酶基因相对表达含量的影响

SOD3、POD3、CAT1分别是抗氧化酶SOD、POD、CAT的关键调控基因。由图7可知， ALA处理下玉米自交系郑58和TS141的SOD3、POD3、CAT1相对表达量与对照相比没有显著变化。在PEG处理下，2个玉米自交系幼苗叶片中抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1相对表达量较CK都有显著提高，郑58分别提高54.58%、34.12%、69.70%，TS141分别提高54.95%、21.36%、59.34%；AP处理进一步提高了抗氧化酶基因SOD3、POD3和CAT1的相对表达量，郑58分别提高20.99%、32.18%和23.51%，TS141分别提高25.97%、23.16%和40.94%。这说明喷施5-ALA能够提高抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1的相对表达量。

图7 不同处理下玉米幼苗抗氧化酶基因表达量Fig.7 Expression of antioxidant enzyme genes in maize seedlings under different treatments

3 讨 论

植物幼苗阶段是受干旱胁迫影响最为严重的时期，与其他作物相比较，玉米前期生长相对缓慢，如果水分供应不及时，玉米的整个生长发育将会受到严重影响[12]。因此，缓解玉米幼苗期的干旱胁迫是提高玉米产量和质量的重要途径。本研究发现，抗旱玉米自交系郑58和干旱敏感自交系TS141在干旱胁迫下幼苗的生长明显受到抑制。喷施5-ALA处理后，玉米幼苗的苗长、鲜重和干重都得到提高，说明5-ALA能够促进干旱胁迫下玉米幼苗的生长，而且对抗旱自交系郑58的缓解效应好于干旱敏感自交系TS141。这与孙阳等[13]对低温胁迫下玉米幼苗生长的缓解效应研究结果一致。

膜质过氧化产物MDA能很好地反映植物膜系统的受损程度，干旱胁迫下MDA和H2O2含量显著提高，说明玉米幼苗受到干旱胁迫后膜系统损伤，导致膜质过氧化产物MDA含量增加。喷施5-ALA后，MDA和H2O2含量明显降低，表明施加5-ALA可以降低玉米幼苗中MDA和H2O2的含量，减缓活性氧的积累，弱化对玉米幼苗的毒害作用。这与Li等[14]在黄瓜上的研究和Liu等[15]在油菜上的研究结果相似。

正常情况下植物体内的活性氧水平处于一种动态平衡，而干旱胁迫会破坏这种平衡，造成植物体内的ROS过多，引发脂质过氧化、蛋白质氧化等一系列毒害植物体的过程[16]。植物将通过提高抗氧化酶的活性来消除过多的活性氧，降低其对植物的毒害作用。SOD、POD、CAT和APX是植物体内重要的抗氧化酶，干旱胁迫下玉米幼苗叶片中SOD、POD、CAT和APX活性显著高于对照，说明植物在受到干旱胁迫后通过提高4种抗氧化酶的活性，清除体内多余的ROS，缓解干旱损伤，提高抗旱能力。喷施5-ALA 后，玉米幼苗叶片中4种酶活性得到进一步提高，说明5-ALA能增强抗氧化酶的活性，从而提高玉米幼苗抗氧化、抗衰老的能力，缓解干旱胁迫对玉米幼苗的毒害作用。安玉艳等[17]研究发现外源5-AlA通过降低春茶的氧化损伤，提高抗氧化酶活性来提高春茶的产量和品质。

叶绿素是植物光合作用过程中必不可少的一部分，当植物体内的光合色素过少或者光合作用强度不够时，可以适当喷施5-ALA来提高叶绿素的含量。本研究表明，干旱胁迫下玉米植株叶绿素含量显著降低，植物光合作用减弱，有机物的积累减少。在5-ALA处理下，玉米植株叶绿素含量得到显著提高，光合作用增强，有机物的积累增加。王嘉楠等[18]研究发现喷施外源5-ALA能够明显增加叶绿素含量，缓解干旱胁迫下小麦幼苗叶片的光合能力，从而提高小麦幼苗的耐旱性。李瑞杰等[19]研究发现5-ALA能提高东北春玉米叶绿素含量。植物光合作用的强度主要通过光合参数来反映。在干旱胁迫下，郑58和TS141幼苗叶片光合参数Pn、Gs、Tr显著降低，光合作用效率下降，喷施5-ALA后，玉米幼苗叶片光合参数Pn、Gs、Tr的下降得到缓解。导致光合作用效率下降的原因有气孔因素和非气孔因素，耐旱自交系郑58的Gs降低，Ci也降低，说明气孔因素是限制郑58光合速率下降的主要原因；干旱敏感自交系TS141的Gs降低，而Ci升高，说明后期植物光合速率下降的主要原因是由非气孔因素导致，喷施5-ALA可以缓解干旱胁迫对玉米幼苗叶片光合作用效率的抑制。王发展等[20]研究发现5-ALA能提高烤烟幼苗叶绿素含量和光合参数Pn、Gs、Tr，从而缓解干旱胁迫对烤烟的伤害，提高烤烟的抗旱能力。

植物叶片气孔作为植物体与大气环境气体交换的重要结构，为了适应干旱胁迫气孔形态特征通常会发生一系列变化[21]。有研究发现，在植物应对逆境胁迫的过程中，叶片气孔密度增加和气孔减小对环境变化的响应更为迅速[22-23]。本研究发现，在干旱胁迫处理下，干旱敏感自交系TS141叶片上表皮单位面积气孔数量远小于耐旱自交系郑58，而气孔长度和宽度大于耐旱自交系郑58。说明耐旱性较强的玉米自交系其叶片气孔个体小且分布紧密，玉米为了适应干旱胁迫，气孔减小防止水分蒸发，叶片生长受到抑制，从而使叶片面积减小，导致单位面积气孔数量上升，这与王凯丽等[24]在棉花中的研究结果一致。另外干旱胁迫下耐旱自交系郑58气孔参数变化幅度大于干旱敏感自交系TS141，可能是郑58耐旱性比TS141强的原因，这说明耐旱性越强的材料气孔在面对干旱胁迫时做出应激反应越强，外源喷施5-ALA对干旱胁迫下2个玉米自交系都有不同程度的缓解作用。

抗氧化酶SOD、POD、CAT的含量及其表达活性受相应基因的调控。干旱胁迫下，抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1的相对表达含量显著提高，从而提高抗氧化酶SOD、POD、CAT的表达活性，加快对过量ROS的清除。喷施5-ALA后，抗氧化酶基因SOD3、POD3、CAT1的相对表达含量增加，玉米幼苗的抗旱性增强。

4 结 论

综上所述，干旱胁迫下玉米幼苗生长明显受到抑制，幼苗叶片中MDA、H2O2含量以及抗氧化酶活性显著提高，叶片中叶绿素含量以及光合参数明显下降，抗氧化酶基因相对表达量明显提高。喷施25 mg·L-1的5-ALA，玉米幼苗的苗长等形态指标、叶绿素含量以及光合参数得到明显提高，叶片中MDA、H2O2含量明显下降，SOD等4种抗氧化酶活性以及抗氧化酶基因相对表达量得到进一步提高，从而提高玉米幼苗的抗旱性。