马铃薯长期连作对土壤真菌群落特征的影响

胡新元，谭雪莲，孙小花，谢奎忠，柳永强

(1.甘肃省农业科学院，甘肃省马铃薯种质资源创新工程实验室，甘肃 兰州 730070; 2.甘肃省农业科学院旱地农业研究所，甘肃省水资源高效利用重点实验室，甘肃 兰州 730070； 3.甘肃省农业科学院马铃薯研究所，甘肃 兰州 730070)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是世界第四大粮食作物，我国是马铃薯种植面积最大的国家，约占世界种植面积的22%[1-2]。由于人口不断增长，预计到2050年全球粮食需求将翻一番[3-4]。中国作为世界第二大经济体，一直在采取措施提高粮食产量，2015年中国农业部启动马铃薯主粮化战略，到2020年，马铃薯面积由5.3×106hm2增加到1.0×107hm2以上[5]。近年来，马铃薯连年种植现象非常普遍，连作会造成环境因子的过度消耗，使土壤微生态环境恶化，植物病原体富集，最终导致作物生长障碍[6]。连作导致马铃薯土传病害逐年加剧，严重影响了马铃薯产业的健康发展。据报道，马铃薯连作2 a，产量没有显著变化，但连作第3年，产量下降17.07%以上[7-8]。有研究表明，微生态系统的失衡是造成连作障碍发生的主要原因之一，土壤微生物类群的变化又会影响土壤微生态功能[6]。马铃薯连作导致的土壤微生物群落结构演替一直以来备受关注。因此，研究不同连作年限下土壤微生物多样性的变化，对于促进马铃薯种植业的可持续发展具有重要意义。

土壤真菌与土传病害的发生密切相关[9]。孟品品等[10]采用PCR-DGGE分子指纹图谱技术研究了马铃薯连作对根际土壤真菌种群结构的影响，研究表明连作使根际土壤中病原真菌成为优势种群,根际微生态环境恶化。李继平等[11]采用稀释平板法和残渣分离法研究了马铃薯连作对土壤病原真菌种群动态变化的影响，发现0～10 cm土层中土传病原真菌菌落数随连作年限的增加而增加。龚静等[12]研究表明，马铃薯连作1季和3季土壤真菌结构相似。研究发现，大豆长期连作，真菌群落结构和功能组成向利于植物健康方向发展[13]。大豆长期连作(6～38 a)，土壤中抑制大豆胞囊线虫的假单胞菌属(Psudomonas)、紫霉属(Purpureocillium)和pochonia丰度逐年增加[14]。与连作3 a相比，大豆连作20 a根际土壤中根腐病病原菌镰孢菌(Fusariumoxysporum)种群密度显著降低[15]。长期种植马铃薯是否有利于抑病土的产生，从而抑制病原菌的生长，改善土壤环境和植株生长，马铃薯是否可以进行适度连作，目前仍罕见报道。因此，本研究采用高通量测序技术，通过研究马铃薯土壤真菌多样性和群落结构在连作条件下的演变规律，以期为解决马铃薯适度连作和土壤微生态修复问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况和试验设计

试验布设在甘肃省定西市安定区宁远镇红土村中川社(35°26.714′N， 104°50.886′E)，海拔1 991 m，试验地为平坦川地，属中温带偏旱区，日照时数2 476.6 h，年均气温6.4℃，≥10℃积温2 239.1℃，无霜期140 d。多年平均降水量390.9 mm，年蒸发量1 531 mm，干燥度2.53，为典型的黄土高原半干旱雨养农业区，土壤为典型的黄绵土。

2010年3月开始进行定位试验，供试品种为：春小麦(定西35号)、豌豆(陇豌1号)、马铃薯(陇薯10号)。试验采用随机区组设计，设6个处理。(1)轮作(R)：马铃薯/小麦/豌豆序列轮作，2019年种植马铃薯；(2)马铃薯连作1 a(C1)：2018—2019 年连续2 a种植马铃薯；(3)马铃薯连作3 a(C3)：2016—2019 年连续4 a种植马铃薯；(4)马铃薯连作5 a(C5)：2014—2019 年连续6 a种植马铃薯；(5)马铃薯连作7 a(C7)：2012—2019年连续8 a种植马铃薯；(6)马铃薯连作9 a(C9)：2010—2019年连续10 a种植马铃薯。C5～C9处理的前茬作物均为春小麦。每个处理3次重复，共18个小区，每个小区面积为23.8 m2(5.67 m×4.2 m)。

1.2 播种、施肥量及田间管理

小麦播种量为187.5 kg·hm-2， 3月下旬播种，7月下旬收获。豌豆播种量为180 kg·hm-2，4月初播种，7月中旬收获。马铃薯种植密度为67 500株·hm-2，4月下旬种植，9月下旬收获。小麦施肥量为纯N和P2O5各105 kg·hm-2，豌豆施肥量为纯N 135.0 kg·hm-2、P2O5108.0 kg·hm-2，马铃薯施肥量为纯N135 kg·hm-2、P2O5108 kg·hm-2。在作物生长季节，杂草采用人工除草，此外无其他田间管理措施。

1.3 取样

马铃薯块茎膨大期采用 “S”形方法取样，从0～20 cm土层采集距离马铃薯根部周围0～2 cm土样，样品混匀后过2 mm筛，装入无菌塑料离心管中，放入液氮中带回实验室，并储存于-80℃冰箱用于微生物分析。

1.4 土壤微生物高通量测序

使用MN NucleoSpin soil Kit (Machery-nagel, Dueren, Germany)从0.75 g土壤中提取总DNA。根据真菌ITS1保守区使用引物ITS1F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2 (5′ -GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。每10 μl PCR混合物中含有5 μl KOD FX Neo Buffer、0.3 μl 10 μM引物、2 μl dNTP(每个2 mmol·L-1)、0.2 μl KOD FX Neo、50 ng DNA，并加入蒸馏水定容至10 μl。每个样品进行重复扩增、合并，然后使用Cycle Pure Kit (Omega, Norcross, GA, USA)进行纯化，形成测序文库，使用Illumina HiSeq 2500技术进行测序分析。

1.5 数据质控和数据处理

每个种植方式对应选取3个独立土壤样品进行ITS测序，鉴定样品中的真菌；测序序列的Q3控制90%以上；从样本中随机抽取一定数量的序列，统计这些序列所代表的物种数目，并以序列数与物种数来构建曲线，控制序列数取值在曲线平缓段，保证测序数据量饱和，足以反映样品中的物种多样性。

用QIIME软件挑选出属分类学水平上丰度最高的OTU序列作为代表序列，进行多重序列比对并构建系统进化树，然后通过Python语言工具绘制图形。通过Beta多样性分析来比较不同样品在物种多样性方面(群落组成及结构)存在的差异大小，根据距离矩阵获得相应距离下的样品层次聚类树，并进行非度量多维标定(Non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)分析。

2 结果与分析

2.1 土壤丰富度和多样性比较

采用高通量测序技术对马铃薯土壤真菌群落的α-多样性指数进行了分析。马铃薯连作年限对土壤真菌群落丰富度有显著影响，相似性水平为97%(图1)。随着马铃薯连作年限的增加，土壤真菌菌群丰度和Chao1显著增加。连作7 a和9 a的马铃薯土壤真菌菌群丰度最高，马铃薯/春小麦/碗豆轮作的马铃薯土壤真菌菌群丰度最低。C7与C9间无显著差异，而C7、C9与R、C1 C3间差异显著。表明连作年限的增加使土壤真菌群落的丰富度和多样性提高。

注：不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。Note:Different letters indicate significant differences among different treatments (P<0.05).图1 马铃薯连作年限对土壤真菌群落Chao1和菌群丰度的影响Fig.1 Effect of potato continuous cropping years on Chao1 and community richness of soil fungal communities

2.2 土壤真菌群落组成

对马铃薯土壤真菌群落的分布进行了分析(图2)，置换检验(Permutation test)表明，种植年限对马铃薯土壤真菌群落的分布有显著影响(R2=0.56，P<0.001)。从图2可以看出，C7和C9处理比较接近，说明这两个处理的真菌群落相似度较高，他们和R处理的距离较远，C1、C3和C5处理位于R处理和C7、C9处理之间，证明C7和C9处理与R处理的真菌群落相似度低，真菌群落差异显著。

注：NMDS是基于真菌群落组成的布雷-柯蒂斯距离。误差条表示标准误差。Note:NMDS are based on Bray-Curtis distances according to fungal community composition. Error bars indicate standard errors.图2 不同马铃薯连作年限下土壤真菌群落的非度量多维尺度(NMDS)图Fig.2 NMDS plot showing the shift of fungal communities in relation to potato continuous cropping years

2.3 土壤纲水平真菌群落组成

对检测到的>90%的真菌群落在纲水平的分类进行分析(图3，见189页)，可以看出，试验供试样本主要富集的13个真菌纲：锤舌菌纲(Leotiomycetes)、伞菌纲(Agaricomycetes)、壶菌纲(Chytridiomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、子囊菌纲(Ascomycota_unidentified)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)、盘菌纲(Pezizomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、酵母纲(Saccharomycete)、Fungi_unidentified、Archaeorhizomycetes、伞型束梗孢菌纲(Agaricostilbomycetes)。土壤真菌群落的相似度总体分为两类，C7和C9处理为一组，其他处理分为一组。R、C1、C3、C5间差异较小，长期连作C7和C9间差异较小，而R、C1、C3、C5与C7、C9间差异较大，说明连作7 a后马铃薯田土壤真菌群落结构发生较大改变。再细分，R处理和C1、C3、C5处理分开，可以分为3组，这和图2的真菌群落相似度分类相似，说明马铃薯轮作和连作也会引起土壤微生物群落一定的变化。

注：*表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。Note: * shows significant differences among treatments (P<0.05)，the same below.图3 连作年限对马铃薯田土壤纲水平真菌群落影响的热图Fig.3 Heat map shows the effects of continuous cropping years on potato soil fungal community at class level

2.4 土壤有害真菌属水平的分类与分布

在不同种植年限的马铃薯农田土壤中，共检测到273个真菌属，其中平均相对丰度>0.15%的真菌属有44个，对检测到的丰度排名前44的真菌属进行差异分析，其中，13个真菌属在不同处理的马铃薯农田土壤中差异显著(图4)，分别为：镰刀菌属(Fusarium)、Nectriaceae、灵芝属(Ganoderma)、Metarhizium、Lecanicillium、木生红曲霉属(Xylogone)、丛赤壳属(Nectria)、Ascomycota_unidentified、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillum)、头梗霉(Cephaliophora)、隐球菌属(Cryptococcus)、刚毛四枝孢菌属(Tetracladium)。青霉菌在连作5、7 a和9 a的土壤中数量显著高于轮作。潜在的有害病菌为镰刀菌属(Fusarium)、Nectriaceae、灵芝属(Ganoderma)、绿僵菌属(Metarhizium)、Lecanicillium、木生红曲霉属(Xylogone)、丛赤壳属(Nectria)，其中，镰刀菌属是引起马铃薯枯萎病的土传病原真菌。镰刀菌属种类很多，本研究土壤中主要是尖孢镰刀菌(F.oxysporum)，而绿僵菌属在马铃薯连作土壤中属于拮抗菌，没有致病性。

注：+表示该真菌属为潜在的有害病菌。Note:+ indicates that the fungus is a potentially harmful pathogen.图4 连作年限对马铃薯田土壤属水平真菌群落影响的热图Fig.4 Heat map shows the effects of continuous cropping years on potato soil fungal community at genus level

土壤潜在有害病原真菌属水平丰度聚类分析显示(图5)，不同连作年限潜在病原菌群落可以分为两组，C5、C7、C9处理为一组，R、C1、C3为一组，同一组内真菌群落组成类型相似。结果表明马铃薯连作5、7 a和9 a群落组成在属水平上相似性较高，而马铃薯轮作、连作1 a、连作3 a群落组成在属水平上相似性较高。由此可见，当马铃薯连作5 a以后，土壤潜在病原真菌种群丰度开始发生较大变化。病原菌镰刀菌属(Fusaruim)在C5中相对丰度达最高，显著高于R、C1、C3以及C7、C9。拮抗菌绿僵菌属(Metarhizium)在C5、C7、C9中相对丰度显著高于R、C1、C3。

3 讨 论

连作障碍的产生与土壤微生物的多样性密不可分，土壤真菌多样性和数量与土壤健康状况呈负相关[16]，长期连作使作物土壤微环境发生改变，土壤真菌多样性和丰富度有所提高，破坏了原有土壤微生物群落的结构，影响作物的健康生长[17-18]。目前不同作物不同连作年限的研究结果不尽相同。赵存鹏等[6]研究得出，轮作后棉花根际土壤中真菌Chao1、ACE和Shannon指数显著高于连作棉田。张子龙等[19]研究表明，小麦/三七轮作土壤真菌群落多样性和丰富度显著高于三七连作。刘珊廷等[20]研究表明木薯轮作根际土壤中Shannon指数和Chao1指数均高于连作。而本研究发现，随着连作年限的增加，真菌多样性指数呈上升趋势。马铃薯连作5 a Richness显著高于小麦/马铃薯轮作，马铃薯连作7 a和9 a菌群丰度显著高于连作1、3 a以及小麦/马铃薯轮作，马铃薯连作3 a的Chao1显著高于小麦/马铃薯轮作，马铃薯连作5、7 a和9 a与连作3 a和轮作处理间差异显著。说明随着马铃薯种植年限的延长，马铃薯田真菌多样性呈上升趋势。这与大豆连作20 a的根际土壤真菌种群的多样性显著高于3 a短期连作的研究结论一致[15]。

连作通常会使得土壤中真菌致病菌数量增加，植株根系释放的分泌物也会促进病原菌的繁殖和生长，同时抑制有益细菌的生长，使病原菌成为优势种群而引发土传病害，使作物植株生长发育不良而引起产量和品质下降[21-22]。本研究中，从真菌属分类水平进行分析，马铃薯土壤中优势真菌属包括镰刀菌属(Fusarium)、Nectriaceae、灵芝属(Ganoderma)、绿僵菌属(Metarhizium)、Lecanicillium、木生红曲霉属(Xylogone)、丛赤壳属(Nectria)等致病病原菌；在我国，马铃薯土传病害主要有枯萎病(Fusariumsp)、干腐病(Fusariumsp)、青枯病(Ralstoniasolanacearum)、黄萎病(Verticilliumdahliae)、黑痣病(Rhizoctoniasolani)、疮痂病(Streptomycesscabies)、粉痂病(Spongosporasubterranean)等。已有研究显示，镰刀菌属(Fusaruimspp.)是引起马铃薯枯萎病和干腐病的土传病害致病菌[11]。本研究中，镰刀菌属在连作土壤中的丰度较高，尤其是连作第5年的土壤，这与刘星等[23]研究显示，Fusariumsp.、Fusariumsolani在马铃薯连作土壤中数量均增加的结论一致。

马铃薯枯萎病病原菌种类随地域不同而有差异，其致病力也不一致。引起枯萎病的病原菌镰刀菌(Fusariumspp.)主要有茄病镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、接骨木镰刀菌(F.sambucinum)、雪腐镰刀菌(F.nivale)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)、三线镰刀菌，锐顶镰刀菌(F.acuminatum)和燕麦镰刀菌(F.avenaceum)等[24]。河北马铃薯枯萎病病原菌为茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌[25]。内蒙古和甘肃马铃薯枯萎病病原菌有尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和三线镰刀菌[25]，甘肃马铃薯枯萎病病原菌还有燕麦镰刀菌[26]。本研究中，马铃薯连作土壤中尖孢镰刀菌(F.oxysporum)在连作5 a的土壤中大量富集，说明在甘肃定西马铃薯种植区内，尖孢镰刀菌是导致马铃薯发病的主要致病菌。同时，尖孢镰刀菌也是河北、内蒙、甘肃马铃薯枯萎病的主要致病菌。

然而，长期连作的效果不一定是负面的，有研究发现，作物连作可能引起拮抗菌逐年富集[27]，某些有益菌数量也会增加[28]，这些有益菌群通常产生一些激素类化合物，通过促进作物养分吸收、抑制病原菌生长等方式来促进植物生长。一些作物在一定连作年限后土壤逐步得到自我恢复，并且连作障碍程度趋于减轻甚至消失[29]。本研究中，Ascomycota_unidentified、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillum)、头梗霉(Cephaliophora)、隐球菌属(Cryptococcus)、刚毛四枝孢菌属(Tetracladium)等有益菌真菌属在不同处理的马铃薯根部土壤中差异显著。其中，青霉菌在连作5、7 a和9 a的土壤中数量显著高于轮作。青霉菌(Penicillium)参与有机物的分解，促进土壤碳和氮的循环，降解土壤中的有害物质[30]，其产生的代谢活性物质对部分镰刀菌属(Fusarium)病原菌产生明显抑制作用[31]。这有可能是镰刀菌在连作5 a的土壤中数量达到最高，在连作7 a和9 a的土壤中数量又开始显著降低的原因，与大豆连作20 a的土壤中，镰孢菌数量显著低于3 a连作的结论一致[15]。本研究中，绿僵菌属(Metarhizium)在马铃薯连作5、7 a和9 a的土壤中相对丰度显著增加。绿僵菌属(Metarhizium)可以对植物病害产生拮抗作用[32]，同时促进植物对氮素营养的吸收，增强植物抗病性[33]，还可以分泌各种有机酸溶解土壤中固态磷，提高作物养分利用率[34]。

4 结 论

1)与马铃薯轮作农田相比，马铃薯连作7 a和9 a的农田土壤真菌菌群丰度和Chao1显著提高，说明马铃薯连作7 a后，农田土壤真菌群落的丰富度和多样性增加。

2)对马铃薯土壤真菌群落的分布进行分析，表明C7和C9真菌群落结构相似度较高，C1、C3、C5真菌群落结构相似度较高，C7和C9与R的真菌群落结构差异较大，C1、C3、C5的真菌种群群落结构介于C7、C9与R之间。说明马铃薯长期连作会引起土壤微生物群落的变化，尤其是连作7 a真菌群落结构发生较大改变。

3)引起马铃薯枯萎病的土传致病菌镰刀菌属(Fusaruim)在C5中相对丰度达最高，显著高于R、C1、C3以及C7、C9。有益菌青霉菌(Penicillum)在C5、C7和C9的土壤中数量显著高于R。拮抗菌绿僵菌属(Metarhizium)在C5、C7、C9中相对丰度显著高于R、C1、C3。马铃薯连作5 a和7 a的农田土壤中拮抗菌和有益菌大量富集，同时，土传病原菌在连作5 a土壤中也大量富集，但是在连作7 a和9 a土壤中数量逐渐下降。