鹿茸多糖对MC3T3-E1成骨细胞与BMSCs骨髓间充质干细胞增殖与分化的作用研究

张 博 冯天璞 刘元媛

锦州医科大学，辽宁 锦州 121001

骨质疏松为中老年人群常见慢性病，尤其是中老年女性骨质疏松症更为普遍，患病后容易出现骨质疏松性疼痛，极大地增加了骨折的风险，严重影响中老年人群的生活质量。目前治疗骨质疏松症的常用药物有抗骨代谢类药物，如雌激素、选择性雌激素受体调节剂、双磷酸盐类、降钙素类等；促骨合成类药物，如甲状旁腺激素类药物[1-2]。这些药物虽然有一定疗效，但是也存在着副作用的风险，如：雌激素与子宫内膜癌、乳腺癌之间的关系仍然存在着争议；结合型雌激素会明显升高HDL胆固醇水平；双膦酸盐类药物容易产生颌骨坏死、肌肉骨骼痛、食道癌、肾功能衰竭不良反应等。有研究[3-4]表明，中药在提高骨密度、缓解骨质疏松性疼痛等方面具有显著作用，并且具有副作用小、适合长期服用等优势，因此，医药学界近年来对中药治疗骨质疏松症的研究尤为重视。

鹿茸作为中药使用历史悠久，《中国药典》记载鹿茸具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任，托疮毒等功效。现代药理研究[5]发现鹿茸具有恢复心肌功能、调节免疫、促进性功能、抗疲劳、防治骨质疏松等多种活性。有研究[6]表明，鹿茸药材中的多糖成分具有改善骨质疏松症状的作用，因此，本文以鹿茸中的多糖成分为研究对象，探讨鹿茸多糖对MC3T3-E1成骨细胞以及BMSCs骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响，为进一步阐明鹿茸抗骨质疏松症的有效成分和作用机制提供参考。

1 实验材料

1.1 仪器 酶标仪(Bio-TeK，美国)；CKX41SF倒置显微镜( OLYMPU S，日本)；MCO-15AC型CO2培养箱(SANYO，日本)；800离心机(江苏金坛市城西晓阳电子仪器厂)；101-(1)型电热恒温鼓风干燥箱(上海路达实验仪器有限公司)；MDF-192型超低温冰箱(Sanyo，日本)；优普超纯水制造系统(中国)；24 孔、96 孔培养板(greiner，德国)；15 mL 离心管(greiner，德国)；移液器(Select BioProducts，美国)；MLS-3780 高压灭菌器(SANYO，日本)。

1.2 细胞 小鼠MC3T3-E1成骨细胞、大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞均购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。

1.3 试药 MEMα(含核苷)培养基、原代间充质细胞培养体系购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；胎牛血清FBS购于clark；青霉素、链霉素购于大连美仑生物技术有限公司；PBS 平衡盐溶液购于武汉博士德生物工程有限公司；0.25%胰蛋白酶购于Gibco公司；CCK-8购于美国APExBIO生物科技有限公司；小鼠碱性磷酸酶(ALP)ELISA试剂盒、大鼠碱性磷酸酶(ALP)ELISA试剂盒均购于武汉博士康生物工程有限公司。

1.4 鹿茸多糖提取液的制备 鹿茸药材粉碎，过80目筛，加10倍量石油醚(60～90 ℃)脱脂2次，残渣加30倍量水，80 ℃回流提取两次，滤过，合并滤液，将滤液浓缩至适量，加乙醇调至含醇量为70%，静置12 h，分取沉淀物，用乙醇洗涤2次，蒸干，精密称取干燥提取物适量，加水溶解，使成浓度为30 mg/mL，无菌条件下以0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2 实验方法

2.1 鹿茸多糖对小鼠MC3T3-E1成骨细胞的影响

2.1.1 鹿茸多糖最佳起效量的确定 将生长状态良好的小鼠MC3T3-E1成骨细胞制备成单细胞悬液，以4×104个/mL的浓度接种于96孔板上，每孔100 μL。实验分为6组，分别为给药组1、2、3、4、5与空白对照组，每组设8个复孔。24 h后，弃去培养基，每孔加入不同量多糖提取液，再加入适量培养基，使终浓度分别为0.05 μg/μL、0.3 μg/μL、0.6 μg/μL、0.9 μg/μL、1.2 μg/μL，空白组只加培养基。药物干预24 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，将培养板置于37 ℃恒温培养箱中孵育1 h，取出，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度(OD)值。采用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差分析处理。

2.1.2 鹿茸多糖对小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响[7-10]将生长状态良好的小鼠MC3T3-E1成骨细胞制备成单细胞悬液，以4×104个/mL的浓度接种于96孔板上，每孔100 μL，共接种3板。实验分为两组，分别为空白对照组与多糖组，每组设8个复孔。24 h后，弃去培养基，每孔加入多糖提取液，再加入适量培养基，使终浓度为0.9 μg/μL，空白组只加培养基，分别于药物干预24 h、48 h、72 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，将培养板置于37 ℃恒温培养箱中孵育1 h，取出，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度(OD)值。采用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差分析处理。

2.1.3 鹿茸多糖对小鼠MC3T3-E1成骨细胞分化的影响[11-12]将生长状态良好的小鼠MC3T3-E1成骨细胞制备成单细胞悬液，以5×104个/mL的浓度接种于24孔板上，每孔500 μL，共接种3板。实验分为两组，分别为空白对照组与多糖组，每组设4个复孔。24 h后，弃去培养基，每孔加入鹿茸多糖提取液，再加入适量培养基，使终浓度为0.9 μg/μL，空白组只加培养基。分别于药物干预24 h、48 h、72 h后，弃去培养液，收集细胞，采用ELISA法对细胞内ALP蛋白酶活性进行检测，采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析处理。

2.2 鹿茸多糖对大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞的影响

2.2.1 鹿茸多糖最佳起效量的确定 将生长状态良好的大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞制备成单细胞悬液，以5×104个/mL的浓度接种于96孔板上，每孔100 μL。实验分为6组，分别为给药组1、2、3、4、5与空白对照组，每组设8个复孔。24 h后，弃去培养基，每孔加入不同量的多糖提取液，再加入适量的培养基，使终浓度分别为0.3 μg/μL、0.6 μg/μL、0.9 μg/μL、1.2 μg/μL、1.8 μg/μL，空白组只加培养基。药物干预24 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，将培养板置于37 ℃恒温培养箱中孵育1 h，取出，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度(OD)值。采用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差分析处理。

2.2.2 鹿茸多糖对大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞增殖的影响 将生长状态良好的大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞制备成单细胞悬液，以5×104个/mL的浓度接种于96孔板上，每孔100 μL，实验分为两组，分别为空白对照组与多糖组，每组设8个复孔，共接种3板。24 h后，弃去培养基，每孔加入多糖提取液，再加入适量的培养基，使终浓度为1.2 μg/μL，空白组只加培养基，分别于药物干预24 h、48 h、72 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，将培养板置于37 ℃恒温培养箱中孵育1 h，取出，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度(OD)值。采用SPSS 17.0统计软件对数据进行单因素方差分析处理。

2.2.3 鹿茸多糖对大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞分化的影响[13-15]将生长状态良好的BMSCs骨髓间充质干细胞制备成单细胞悬液，以6×104个/mL的浓度接种于24孔板上，每孔500 μL，共接种3板，实验分为两组，分别为空白对照组与多糖组，每组设4个复孔。24 h后，弃去培养基，每孔加入多糖提取液，再加入适量培养基，使终浓度为1.2 μg/μL，空白组只加培养基，每3天换一次液，分别于药物干预5 d、10 d、15 d后，弃去培养液，收集细胞，采用ELISA法对细胞内ALP蛋白酶活性进行检测，采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析处理。

3 实验结果

3.1 鹿茸多糖对小鼠MC3T3-E1成骨细胞作用的最佳起效量确定 以鹿茸多糖提取液对小鼠MC3T3-E1成骨细胞干预24 h后，细胞的活性随着药物浓度的增加而明显增强，并且与空白对照组相比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。在每孔加药量达到0.9 μg/μL后，其增殖作用趋于稳定，因此确定最佳起效量为0.9 μg/μL。结果见表1。

表 1 不同剂量鹿茸多糖作用于MC3T3-E1 24 h后OD值的变化

3.2 鹿茸多糖对小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响 小鼠MC3T3-E1成骨细胞经鹿茸多糖提取液干预增殖24 h、48 h、72 h后，细胞活性随着药物作用时间的增加逐渐增强，并且不同时间点给药组与空白对照组相比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)。结果见表2。

表2 鹿茸多糖作用于MC3T3-E1不同时间后OD值的变化

3.3 鹿茸多糖对小鼠MC3T3-E1成骨细胞分化的影响 以鹿茸多糖提取液干预作用小鼠MC3T3-E1成骨细胞24 h后，ALP蛋白酶活性显著增强，并且与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，作用48 h、72 h后ALP蛋白酶活性有所增强，但与空白组比较没有显著性差异。结果见表3。

表3 鹿茸多糖对MC3T3-E1成骨细胞中ALP(U/L)含量的影响

3.4 鹿茸多糖对大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞作用的最佳起效量确定 以鹿茸多糖提取液干预大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞24 h后，细胞的活性随着药物浓度的增加而明显增强，并且与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。在每孔加药量达到1.2 μg/μL后增殖作用不再显著增强，确定最佳起效量为1.2 μg/μL。结果见表4。

表4 不同剂量鹿茸多糖作用于BMSCs 24 h后OD值的变化

3.5 鹿茸多糖对大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞增殖的影响 鹿茸多糖提取液干预大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞增殖24 h、48 h、72 h后，细胞活性增强作用逐渐减弱，但均强于空白对照组，并且差异均具有统计学意义(P<0.01)。结果见表5。

表5 鹿茸多糖作用于BMSCs不同时间后OD值的变化

3.6 鹿茸多糖对大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞分化的影响 以鹿茸多糖提取液干预大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞5 d和15 d后，细胞内ALP蛋白酶活性有所增加，但与空白对照组没有显著性差异。结果见表6。

表6 鹿茸多糖对BMSCs骨髓间充质干细胞中ALP (U/L)含量的影响

4 讨论

成骨细胞是骨形成的基本功能单位，骨髓间充质干细胞具有多向分化性的特点，在一定诱导条件下可以向成骨细胞分化。对成骨细胞和骨髓间充质干细胞进行体外培养是探索骨质疏松症机制的重要模型[16-17]。实验结果表明，以鹿茸多糖提取液作用于成骨细胞和骨髓间充质干细胞24 h、48 h、72 h后，以CCK-8法检测细胞活力，均高于空白对照组，且差异具有统计学意义，说明鹿茸多糖能够促进成骨细胞与骨髓间充质干细胞的增殖。

碱性磷酸酶(ALP)广泛分布于人体组织和体液，其大部分由骨细胞产生，是成骨细胞成熟的特异性标志，因此检测碱性磷酸酶的活性对成骨研究具有重要意义[18]。实验结果显示，鹿茸多糖提取液干预小鼠MC3T3-E1成骨细胞24 h后，ALP蛋白酶活性增强，且与空白对照组比较差异具有统计学意义，表明鹿茸多糖能够促进小鼠MC3T3-E1成骨细胞的成熟。以鹿茸多糖提取液干预作用大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞5 d、15 d后，ALP蛋白酶活性均有所增加，但与空白对照组比较没有显著性差异。由此可见，鹿茸多糖对大鼠BMSCs骨髓间充质干细胞具有增强分化的趋向，这对于促进骨生成具有积极意义。

综上所述，鹿茸多糖是鹿茸具有抗骨质疏松作用的潜在有效物质之一，能够作用于成骨细胞与骨髓间充质干细胞的增殖和分化等环节，这可能是鹿茸起到促进骨生成、抗骨质疏松作用机制之一。