基于网络药理学及分子生物学验证探讨畲药黄荆条黄酮类成分抗类风湿关节炎的作用机制

朱珊珊 汪 洋 张 奇 秦路平 张巧艳

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜炎为主要特征的自身免疫性疾病，发病率0.3%～1.5%。RA 的临床表现为手腕、足踝等关节部位的对称性疼痛、肿胀和畸形，后期进展为血管炎、神经病变甚至是多器官功能障碍[1-2]。临床上常用抗炎、抗风湿药物及生物制剂，如非甾体抗炎药、糖皮质激素、甲氨蝶呤和肿瘤坏死因子α 抑制剂、B 细胞抑制剂等治疗类风湿关节炎，但长期应用会产生肝肾功能损伤等不良反应，也会导致病情反复和加重疾病发展，存在一定的局限性[3]。畲族人聚居于福建及浙江丽水等地，气候潮湿，RA 的患病率较高，而畲医药对RA 也有其独特的治疗方法。畲药黄荆条是马鞭草科植物牡荆Vitex negundo L.var.cannabifolia（Sieb.et Zucc.）Hand.-Mazz 的根或叶。在畲医药理论体系中黄荆条属于阳药，味微苦，辛、温。黄荆条含有木脂素类、黄酮类和萜类等成分，研究表明，黄荆条的主要黄酮类成分牡荆素对Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠类风湿性关节炎有缓解作用，具有确切的治疗类风湿关节炎作用[4]；黄荆条的黄酮类成分紫花牡荆素可剂量依赖性地抑制佐剂性关节炎小鼠后足爪的肿胀度，显著降低致炎性细胞因子的水平，提高抗炎性细胞因子的水平[5]。本文应用网络药理学方法结合分子生物学验证探索畲药黄荆条中的黄酮类成分抗RA 的作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 试 剂 木犀草素标准品（luteolin，LUT，批号C19N10Q104574，纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批号9048-46-8），美国Gibico 公司；DMEM 培养基，美国Gibico 公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，批号12190801），美国SIGMA 公司；一氧化氮（NO）检测试剂盒（批号011020201014），上海碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号070721211202），上海碧云天生物科技有限公司；CCK8溶液，上海碧云天生物科技有限公司；MMP9 抗体（批号ZP2808BP08①），上海博士德生物工程有限公司；GAPDH Rabbit 抗体（批号2118S），COX-2 Rabbit（批号12282S），AKT1 Rabbit（75692S），HRP Rabbit（批号7074S），均购于Cell Signaling Techno-logy。黄荆条醇提物（HJT-E）2 g/mL 及水提物（HJT-W）2 g/mL（以生药量计）由丽水市人民医院中药实验室制备。

1.2 仪 器 1510 型酶标仪，赛默飞世尔（上海）科技有限公司；ST 16R 高速冷冻离心机，赛默飞世尔（上海）科技有限公司ECLIPSE TS-100F 型倒置荧光显微镜，日本Nikon 公司；二氧化碳培养箱，上海百基生物科技有限公司；GD50202 型化学发光成像系统，莫纳生物科技有限公司；DHG-9123A 型鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 黄荆条黄酮类成分筛选及靶点预测 以“黄荆条”或“牡荆”为关键词在中国知网、万方、维普及TCMSP 中检索筛选黄荆条的黄酮类成分，通过Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索各化合物对应的SMILES 号，分别导入Swiss ADME 平台进行药物相似性预测，导入Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）进行靶点预测，设置物种为Homo sapiens，以Probability*＞0 为条件筛选化学成分的靶基因，获得黄荆条黄酮类活性成分合集及对应的靶点合集。

1.4 RA 治疗靶点的获取与筛选 以“Rheumatoid Arthritis”为关键词在Genecards（http://www.genecards/）和CTD（http://ctdbase.org/）数据库中检索相关靶点。以Relevance score≥10 为条件对Gene cards中获得的靶点进行筛选作为RA 治疗靶点；对CTD中获得的靶点以Inference Score 从大到小排序，选取排名前200 位作为RA 治疗靶点[6]。将两个数据库所得到的靶基因进行归纳整理，删除重复靶点，获得RA 治疗靶点合集。运用Funrich 软件将黄荆条黄酮类活性成分靶点合集与RA 治疗靶点合集进行映射，获得活性成分-RA 共同靶点，并绘制Venn 图。

1.5 活性成分-RA 靶点网络的构建 将黄荆条黄酮类活性成分合集和活性成分-RA 共同作用靶点进行归纳整理，所得数据导入到Cytoscape 3.6.1 软件，构建黄荆条的活性成分-RA 靶点网络。

1.6 靶点蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建及网络拓扑分析 将黄荆条的活性成分-RA 靶点导入STRING 数据库（https://stringdb.org/）构建网络模型，设置物种为Homo sapiens，最低相互作用阈值（medium confidence）为0.4，获得蛋白相互作用关系。将结果进一步导入Cytoscape 3.7.3 软件进行拓扑分析，并构建PPI 网络。

1.7 GO 功能和KEGG 通路富集分析 使用R 软件中的clusterProfiler、enrichplot、ggplot2 等包及自编的R 语言对PPI 网络中参与相互作用的靶点蛋白进行GO 功能和KEGG 信号通路富集分析。GO 富集分析包括了基因的生物学过程，细胞组分和分子功能。KEGG 富集分析研究靶点参与的主要信号通路，物种均设为“Homo sapiens（人类）”，分别选取前20 条条目绘制气泡图（不足20 条的全部选取）。整理获得的靶点和信号通路，运用Cytoscape 3.6.1 软件构建靶点-信号通路网络模型。

1.8 细胞实验验证

1.8.1 细胞及培养 小鼠RAW264.7 单核巨噬细胞（中国科学院细胞库）接种于含10% FBS、100 U/mL青/链霉素的DMEM 培养基中，然后置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，给药前用含10 μg/mL LPS 的DMEM 培养基刺激4 h。

1.8.2 HJT 及LUT 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞增殖的影响 取1.8.1 项下培养的细胞，加入终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL 的HJT-W 和HJT-E，及2.5、5、10、20、40、80 μM 的LUT。培养24 h后每孔加入10 μL 的CCK8 溶液，37 ℃避光孵育2 h，450 nm 下测定吸光度（OD）值。

1.8.3 HJT-E 及LUT 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞NO 生成的影响 取1.8.1 项的细胞加入终浓度分别为12.5、25、50 μg/mL 的HJT-E，及2.5、5、10 μM的LUT，孵育24 h。培养结束后，根据NO 检测试剂盒操作步骤测定各组细胞NO 的生成。

1.8.4 HJT-E 及LUT 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞蛋白表达的影响 取1.8.3 项下经HJT-E 及LUT 干预后培养24h 的细胞，根据蛋白提取试剂盒步骤提取蛋白，并用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性后，-40℃保存用于Western blot 实验。蛋白表达量用各目的蛋白灰度值与相应内参灰度值的比值表示。

1.9 统计学方法 实验数据均应用SPSS 26.0 进行分析，并以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析处理比较完全随机设计的多个样本均数；两组间相互比较：满足方差齐性时采用LSD 检验，不满足方差齐性时采用T2检验；采用双侧检验进行显著性检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄荆条黄酮类成分筛选及靶点筛选 通过检索各文献数据库并通过Swiss ADME 平台预测共获得潜在黄荆条黄酮类活性成分31 个，通过Swiss Target Prediction 对各成分进行靶点预测，共获得存在靶点的活性成分30 个，按Mol-1 至Mol-30 进行命名（表1）；共获得活性成分靶点2103 个，删除重复靶点后最终获得309 个靶点。

表1 黄荆条黄酮类活性成分

2.2 黄荆条黄酮类活性成分治疗RA 靶点的获取通过Genecards 和CTD 检索RA 治疗靶点，筛选整理后共获得RA 治疗相关基因455 个。应用Funrich 对活性成分靶点合集与RA 治疗靶点合集进行映射取交集后，共获得50 个交集基因（见图1），即黄荆条黄酮类活性成分治疗RA 的潜在作用靶点，并获得可作用于该50 个基因的25 个潜在作用成分。

图1 黄荆条黄酮类成分治疗类风湿关节炎的靶点Venn 图

2.3 黄荆条黄酮类活性成分-抗RA 靶点网络构建根据2.2 项下分析得到的潜在作用靶点及靶点与活性成分之间的关系，应用cytoscape 软件构建活性成分-抗RA 靶点网络图。如图2 所示，网络中包含75 个节点及395 条边，其中25 个红色方形节点表示黄荆条黄酮类活性成分，50 个绿色圆圈节点表示RA 靶点，395 条边代表了活性成分与RA 靶点间的相互作用。各活性成分按度值大小进行排序，选取排名靠前8 个活性成分并筛选相对应的靶点构建黄荆条黄酮类活性成分-抗RA 靶点的核心网络。如图3所示，网络中包含43 个节点和173 条边，其中活性成分节点8 个，靶点节点35 个。所涉及的活性成分为Mol-7、Mol-10、Mol-14、Mol-1、Mol-16、Mol-19、Mol-28、Mol-30，这些成分可能是黄荆条治疗RA 的关键性活性成分。

图2 黄荆条黄酮类成分治疗类风湿关节炎的靶点网络

图3 黄荆条黄酮类成分治疗类风湿关节炎靶点的核心网络

2.4 靶点PPI 网络及网络拓扑分析 黄荆条黄酮类活性成分治疗RA 的潜在作用靶点导入STRING 平台中初步构建蛋白互作网络并导出互作数据，整理后应用Cytoscape 软件绘制成一个包含501 个节点和407 条边的PPI 网络图A。应用CytoNCA（Version 2.1.6）插件，以Degree 值（DC）＞17 进行第一次筛选，得到一个包含18 个节点和138 条边的PPI 网络图，再以Betweenness（BC）值＞1.67 进行2 次筛选，得到一个10 个节点和45 条边的PPI 核心网络图B，其过程见图4。第二次筛选后得到PPI 核心网络图C 中包含10个蛋白基因，包括CASP3、MMP9、PTGS2、AKT1、TP53 等，这些靶点与其他靶点关联密切，可能在治疗RA 的过程中占据重要地位。

图4 黄荆条黄酮类成分防治类风湿关节炎的蛋白互作网络拓扑分析图

2.5 GO 分类与KEGG 富集分析结果 应用R 软件对经2 次筛选后得到的PPI 核心网络图C 中的10个蛋白基因进行GO 分类富集分析，结果见图5，共获得GO 条目1297 条（P＜0.05），其中BP 条目1223条，CC 条目7 条，MF 条目67 条，以P 值排序，选取排名前20（不足20 条的全部显示）的路径（见图5），绘制气泡图。结果显示，生物学过程主要涉及活性氧类代谢、氧化应激反应、细胞外结构组织等；细胞成分主要涉及分泌颗粒内腔、胞质囊腔、囊腔等；分子功能主要涉及金属内肽酶活性、金属蛋白酶活性、内肽酶活性等。这些结果表明黄荆条黄酮类成分通过调控多种生物学过程发挥治疗RA 的作用。

图5 黄荆条黄酮类活性成分治疗类风湿关节炎的潜在作用靶点GO 分类富集结果

KEGG 通路分析共获得KEGG 通路（P＜0.05）118条，结果见图6，关键基因涉及的通路主要有AGERAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、p53 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等，涉及了细胞凋亡、炎症反应、细胞增殖、迁移等功能，表明黄荆条黄酮类活性成分通过作用于多条信号通路发挥治疗RA 的作用。

图6 黄荆条黄酮类活性成分治疗类风湿关节炎的潜在作用靶点KEGG 富集结果

2.6 靶点-信号通路网络模型 将排名前20 的KEGG 信号通路及相对应的靶点导入Cytoscape 3.7.1软件中构建靶点-信号通路”网络。如图7 所示，网络中共包含53 个节点和171 条边，其中20 个黄色菱形为信号通路节点，33 个绿色圆形为靶点节点，结果表明黄荆条黄酮类活性成分是通过多靶点、多信号通路共同起到治疗RA 的作用。该网络中度值排名靠前的靶点为AKT1、CASP3、MAPK14、BCL2、TP53 等，分别调控了多条信号通路，表明该5 个靶点在黄荆条黄酮类活性成分治疗RA 的过程中起到了重要的作用。

图7 黄荆条黄酮类活性成分治疗类风湿关节炎靶点-信号通路网络模型

2.7 细胞实验验证 以黄荆条提取物以及网络中的关键成分木犀草素为关键成分代表，并选择相关通路中相对应的关键靶点进行细胞实验验证。

2.7.1 HJT 及LUT 对LPS 刺激的RAW264.7 增殖的影响 如图8 所示，HJT-W 对LPS 刺激的RAW 264.7 细胞的增殖无显著影响（P＞0.05）。HJT-E 的浓度为12.5、25 和50 μg/mL 时能显著抑制LPS 刺激的RAW264.7 细胞的增殖（P＜0.05）；LUT 以剂量依赖性显著抑制RAW264.7 细胞的增殖（P＜0.05），因此，选择2.5、5 和10 μM 进行实验。

图8 HJT 和LUT 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞活力的影响（n=6，）

2.7.2 HJT-E 及LUT 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞NO 生成的影响 如图9 所示，与空白组比较，LPS 刺激的模型组细胞产生NO 的含量显著增加，LUT 和HJT-E 均以剂量依赖性方式抑制LPS 刺激的RAW264.7 细胞产生NO，但只有高剂量有显著性差异（P＜0.05）。

图9 HJT-E 和LUT 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞NO 生成的影响（n=6，）

2.7.3 HJT-E 及LUT 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞蛋白表达的影响 如图10 所示，HJT-E 和LUT 给药治疗后，均能显著抑制因LPS 刺激而表达增加的MMP9、COX-2 和AKT1 蛋白，以高剂量结果最显著（P＜0.05）。

图10 HJT-E 和LUT 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞中MMP9、COX-2 和AKT1 蛋白表达的影响

3 讨论

本研究应用网络药理学方法，探讨黄荆条黄酮类成分治疗RA 的作用机制。通过黄荆条黄酮类活性成分抗RA 靶点预测，得到黄荆条中木犀草素、槲皮素、芹菜素、金合欢素等8 个化合物为抗RA 的活性成分。木犀草素可抑制类风湿关节炎大鼠RANLRP3 炎性小体的表达，降低足跖内Caspase-1、RANKL、VEGF 和HIF-1α 蛋白表达，增强骨组织内骨保护素OPG 蛋白表达，从而发挥骨关节保护作用[7]。槲皮素可通过抑制炎性细胞因子、抗氧化、清除氧自由基、免疫调节、抑制MMPs 和滑膜细胞增生等功能对小鼠胶原诱导性关节炎发挥治疗作用[8]。芹菜素可抑制CIA 小鼠Th1 型细胞功能亢进及Th1/Th2 平衡，减缓RA 发生和进展[9]。尽管本研究预测到金合欢素、艾黄素、5，4'-二羟基-6，7，8，3'-四甲氧基黄酮、5-羟基-3，6，7，8，3'，4'-六甲氧基黄酮及5，7，2'，5'-四羟基黄酮也为抗RA 的有效成分，但尚未发现有相应的文献报道，有待于进一步的实验确证。

基于黄荆条黄酮类活性成分、PPI 网络及KEGG信号通路富集结果，提示黄荆条黄酮类成分治疗RA的核心靶点包括ALB、CASP3、MAPK14、PTGS2、AKT1、TNF 及MMP9 等。RA 主要病理特点为炎性细胞浸润及关节炎症损伤[10]。机体炎症反应引起干细胞损伤可造成白蛋白（ALB）合成减少，同时RA 患者肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平增加也使得机体蛋白分解增加[11]，导致RA 患者ALB 水平明显降低[12]。ALB水平降低常导致机体免疫力下降，抗感染能力减弱[13]，加剧了RA 的发生和发展。CASP3 是调节细胞凋亡的重要基因，其表达下降导致细胞增生与凋亡失衡，导致滑膜细胞的过度增生[14]。丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase14，MAPK14）是MAPK 通路的重要组成部分，阻断MAPK 通路的激活，能够抑制RA 成纤维样滑膜细胞的迁移与侵袭，减轻RA 的症状[15]。PTGS2 又称COX-2，RA 患者滑膜组织COX-2 的表达显著增加，导致PGE2 和炎症因子产生，引起炎性细胞浸润、滑膜组织异常增生，导致关节肿胀、退变。COX-2 抑制剂可减少PGE2 的合成，减轻RA 炎症损伤，改善病情[16-19]。基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的功能为降解骨基质和软骨，其在关节成纤维滑膜细胞上高表达，使其侵袭力增强，导致骨基质和软骨的破坏[20]。高表达的MMP9 可与VEGF 协同刺激内皮细胞，促进血管再生和血管翳的形成，加剧了对软骨的侵蚀破坏[21]。本研究结果显示，黄荆条黄酮类成分可通过多靶点发挥免疫调节、抗炎、抗凋亡和抑制基质降解酶活性等作用减轻RA 症状，减缓其发生发展。

GO 分类富集和KEGG 通路富集分析结果显示，黄荆条黄酮类成分主要通过调控活性氧类代谢、氧化应激反应、细胞外结构组织、胶原分解代谢过程、活性氧代谢过程的调节等生物学过程，通过AGERAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、p53 信号通路、PI3K-Akt 信号通路，进而调节细胞凋亡、炎症反应、细胞增殖等功能发挥治疗RA 的作用。

细胞实验验证过程中发现，HJT-W 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞无增殖作用，而黄酮类成分主要存在于醇提物中，这与本文选择黄酮类成分为研究对象相符。此外，HJT-E 及LUT 均能抑制MMP9、COX-2 和AKT1 蛋白的表达来抑制LPS 诱导的炎症的发展，进一步证实了LUT 作为黄荆条黄酮类成分发挥抗RA 的关键成分，可作用于信号通路中多个炎症因子发挥抗炎作用，与预实验时的分子对接结果相互佐证，验证了本研究中系统网络药理学筛选结果和预测分子机制的可靠性和准确性。

总之，本文通过网络药理学分析，结合文献报道，推测畲药黄荆条中黄酮类成分木犀草素、槲皮素、芹菜素、金合欢素、艾黄素、5，4'-二羟基-6，7，8，3'-四甲氧基黄酮、5-羟基-3，6，7，8，3'，4'-六甲氧基黄酮及5，7，2'，5'-四羟基黄酮可能通过ALB、CASP3、MAPK14、PTGS2、AKT1、TNF 及MMP9等靶点，调控AGE-RAGE、IL-17、TNF、p53 和PI3KAkt 信号通路，抑制RA 滑膜细胞增殖、促进细胞凋亡，缓解炎症反应，最终发挥治疗RA 的作用。