基于网络药理学探讨干姜黄芩黄连人参汤改善2型糖尿病胰岛素抵抗的作用机制

彭智平 张琳琳

国际糖尿病联合会糖尿病地图集显示，全球约有4.63 亿糖尿病患者，中国糖尿病患者约为1.16亿，占全球糖尿病患者总数的1/3[1]，其中糖尿病不同类型中又以2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）为主。胰岛素抵抗是T2DM 的主要发病机制之一，而传统医学具有多成分、多靶点及多途径的特点，对改善胰岛素抵抗具有较大的优势[2-3]。干姜黄芩黄连人参汤属于经典名方，前期研究与文献报道已明确该方可改善胰岛素抵抗[4]，然而其机制未有进一步阐释。网络药理学是采用多种数据库网络分析药物、成分、疾病与靶点之间关系的药理学分支学科，可以在一定程度上提示药物对疾病的作用机制，故本研究借助网络药理学方法分析干姜黄芩黄连人参汤干预的机理，为该方下一步深入基础实验研究和临床应用提供依据[5-6]。

1 材料与方法

1.1 干姜黄芩黄连人参汤药物活性成分与靶点筛选借助中药系统药理学数据库与分析平台[7]（traditional Chinese medicine systems pharmacology atabase and analysis platform，TCMSP），根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 的2 个ADME [“吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）和外排（excretion）”的简称]属性值进行药物主要活性成分筛选，以及药物活性成分作用的蛋白质靶点，并在Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org）规范靶点基因[8]。

1.2 T2DM 基因靶点的筛选 采用常用的OMIM 数据库（http://www.omim.org）、DrugBank 数据库（https://www.drugbank.ca）、Genecards 数据库（https://www.genecards.org）等，其中Genecards 数据库中分数（Score）越高表示与疾病关系越紧密，T2DM 在该数据中由于靶点较多，故根据目标靶点多次取大于中位数的基因靶点为疾病潜在靶点，然后合并3 个疾病数据库基因靶点，最后删除重复基因靶点即为T2DM 对应的基因靶点。

1.3 干姜黄芩黄连人参汤成分与T2DM 靶点蛋白互作（protein protein interaction，PPI）网络构建 根据干姜黄芩黄连人参汤药物成分基因靶点与T2DM 基因靶点取交集，两组基因靶点绘制韦恩图，筛选出重叠基因，利用String11.0 数据库（https://string-db.org）构建PPI 网络图，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”（＞0.4），其余设置均为默认设置，得到PPI 网络。

1.4 干姜黄芩黄连人参汤成分与T2DM PPI 网络图中核心靶点的筛选 运用CytoScape3.7.1 软件构建干姜黄芩黄连人参汤成分与T2DM 交集基因靶点网络图，利用CytoScape3.7.1 内置工具分析交集靶点的网络拓扑参数，根据节点之间属性值，包括连接度（degree）、介度（betweenness）及紧密度（combined score）等，并根据网络拓扑学参数节点大小、颜色及粗细判断核心靶点。

1.5 生物信息分析 应用Metascape 平台（http://metascape.org/gp/index.html）的数据资料[9]，将干姜黄芩黄连人参汤治疗T2DM 的靶点录入Metascape 平台，物种设置为H.sapiens，然后进行个性分析，P＜0.01，从而得到其生物学过程与通路富集分析。

2 结果

2.1 干姜黄芩黄连人参汤活性成分靶点的获取 分析得到干姜黄芩黄连人参汤方中主要含有81 个活性成分（干姜5 个，黄连14 个，黄芩36 个，西洋参11个，知母15 个），其中重复值采用统一代号命名，共得到60 种候选化合物。干姜含有姜辣素等，对应的基因靶点有PIK3CG、KCNH2、DRD1、CHRM3、CHRM1、SCN5A、GABRA2、CHRM4、PDE3A、HTR2A等；黄芩的主要成分含有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素等，对应的基因靶点有NOS2、PTGS1、AR、PTGS2、DPP4、PRSS1、NCOA2、PIK3CG、CHEK1、ADRB2、PDE3A、RELA、BCL2、CDKN1A 等100 多种；黄连的主要成分含有黄连碱、药根碱、小檗碱、巴马汀等，对应的基因靶点有PIK3CG、NCOA2、DPP4ERBB2、PPARG、ACACA、HMOX1、CYP3A4、CYP1A2 等100多种；西洋参含有人参皂苷Rg、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1 等，对应的基因靶点有PTGS2、PGR、NR3C2、NCOA2、PTGS1、PTGS2、PIK3CG、KCNH2 等；知母含有芒果苷、知母皂苷B 等，对应的基因靶点有CHRM1、ADRB1、SCN5A、HTR2A、ADRA1A、CHRM2、ADRA1B、GABRA1 等。该方的药物成分-靶点网络图，见图1。

图1 药物、成分与基因靶点图

2.2 T2DM 基因靶点的获取 根据T2DM 基因靶点数据库的筛选，从OMIM 数据库获取508 个基因靶点，DrugBank 数据库获取101 个基因靶点，Genecards 数据库获取1537 个基因靶点。由于Genecards 数据库中原始靶点基因较多，根据筛选靶点基因目标，设定Score 大于中位数的目标靶点为T2DM 的潜在靶点，并且按照此方法进行多次筛选，共筛选出1537 个基因靶点为T2DM 的潜在靶点。把OMIM、DRUGBANK、Genecards 数据库合并后删除重复值，最终得到2062 个T2DM 的基因靶点。

2.3 干姜黄芩黄连人参汤成分与T2DM 靶点PPI 网络的构建 通过筛选干姜黄芩黄连人参汤药物活性成分靶点与T2DM 疾病靶点取交集，并绘制韦恩图，得到干姜黄芩黄连人参汤成分与T2DM 共同靶点148 个（见图2），具体如下：XDH、VEGFA、VCAM1、TP53、TNF、THBD、TGFB1、STAT1、SPP1、SOD1 等。进而将靶点提交至STRING11.0 平台，得到干姜黄芩黄连人参汤靶点PPI 网络（见图3）。

图2 成分靶点图与疾病靶点图

图3 蛋白互作网络图

2.4 干姜黄芩黄连人参汤成分与T2DM 网络图中核心靶点的获取 运用CytoScape3.7.1 软件构建干姜黄芩黄连人参汤成分与T2DM-交集基因靶点-通路网络，利用String11.0 数据库获取string_interactions.tsv 插件，然后把该插件导入CytoScape3.7.1 软件（见图4）。通过CytoScape3.7.1 内置的NetworkAnalyzer分析干姜黄芩黄连人参汤治疗T2DM 网络拓扑学参数，得到核心作用靶点：TNF、IL-6、TP53、CASP3、IL-10、MAPK1、AKT1、VEGFA、MMP9、EGFR1、MYC、PTGS2、MAPK8、EGF、IL-1β 等。

图4 蛋白互作网络互作图

发现在该关键靶点信息中免疫炎症基因靶点较多，故而进一步提取了这些节点相互作用关系进行分析，得到了PPI 网络结构图中IL-6、IL-10、IL-1β、TNF等基因靶点PPI 网络互作图中相互作用（见图5）。

图5 蛋白互作网络互作图关键节点之一

2.5 交集基因靶点基因本体（gene ontology，GO）生物功能与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 应用Metascape 数据平台对干姜黄芩黄连人参汤治疗T2DM 相关靶点进行信号通路分析，得出干姜黄芩黄连人参汤主要参与的生物学过程与富集通路包括AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、NF-κB 信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、JAK-STAT 信号通路（Jak-STAT signaling pathway）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）、IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）等多种信号通路干预T2DM。

3 讨论

干姜黄芩黄连人参汤出自《伤寒论·厥阴病篇》，原方由黄芩、黄连、人参、干姜四味药组成，后经笔者导师仝小林教授化裁以西洋参易人参，并加入知母，在临床干预T2DM 中具有较好疗效。从方中药物分析可知，黄芩、黄连苦寒清胃热，佐以干姜辛温散寒以防芩连过于苦寒伤胃，药物寒热配伍使胃热得清而不伤胃，辛开苦降合用而有利于中焦脾胃升清降浊、斡旋气机，西洋参甘温扶脾补益中气，全方共奏清胃热健脾益气之功，符合“消瘅”的脾虚胃热型病机特点[10-12]。而T2DM 属中医中医“消瘅”范畴，仝小林院士提出糖尿病的自然发展进程其中之一即为“消瘅”—消渴—消渴并发症，其中“消瘅”的病位在脾胃，核心病机为脾虚胃热，治宜清胃健脾，该治则符合干姜黄芩黄连人参汤的核心病机[13]。且前期研究也已表明，干姜黄芩黄连人参汤可改善胰岛素抵抗，为进一步探索该方的作用机制，本实验研究借助网络药理学技术，剖析了干姜黄芩黄连人参汤改善胰岛素抵抗的关键作用靶点与可能作用机制。

本实验研究通过网络药理学方法筛选出干姜黄芩黄连人参汤60 种活性成分，包含有黄芩苷、黄芩素、黄连碱、药根碱、人参皂苷、芒果苷、知母皂苷、姜辣素等，得到220 个基因靶点，构建了药物-成分-靶点网络图，结果表明一个药物的一个成分可同时作用于多个基因靶点，同时多个药物的多个成分也可以作用于同一个基因靶点，故提示干姜黄芩黄连人参汤是通过多成分多靶点多途径起到干预治疗作用。

本实验下一步获取了T2DM 的基因靶点，按照获取基因靶点目标筛选，最终得到2062 个基因靶点。然后与干姜黄芩黄连人参汤药物活性成分靶点取交集，共得到共同靶点148 个，最后通过对交集基因进行PPI 蛋白互作网络分析，而且通过CytoScape3.7.1 软件分析得到核心作用基因靶点：TNF、IL-6、TP53、CASP3、IL-10、MAPK1、AKT1、VEGFA、MMP9、EGFR1、MYC、PTGS2、MAPK8、EGF、IL-1β等，在核心基因靶点中发现以IL-6、IL-10、IL-1β、TNF等调节免疫炎症基因靶点在PPI 网络互作图中相互作用明显，这也就提示干姜黄芩黄连人参汤可能是通过免疫炎症途径干预T2DM 的作用机制。

通过GO 生物功能与KEGG 通路富集分析，发现干姜黄芩黄连人参汤可通过AGE-RAGE 信号通路、NF-κB 信号通路、钙信号通路、JAK-STAT 信号通路、TNF 信号通路、IL-17 信号通路、Toll 样受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路等多种信号通路干预T2DM，初步揭示了该方具有调控多种信号通路改善T2DM 胰岛素抵抗的作用。

总之，本实验研究初步表明，干姜黄芩黄连人参汤具有改善T2DM 的作用，体现了该方多成分、多靶点及多途径的作用特点，且可能通过免疫炎症途径改善T2DM 的重要作用途径，下一步拟通过动物实验应用酶联免疫吸附法、流式细胞术与蛋白组学技术Western blot 法等检测技术进一步明确干姜黄芩黄连人参汤干预T2DM 的生物学机制。