安阳市内黄县花生果腐病病原种类鉴定及发生动态研究

芦连勇，华福平，王 艳

（安阳市农业科学院，河南 安阳 455000）

花生是河南省的主要油料和经济作物，播种面积仅次于小麦和玉米，花生是河南省第三大农作物。花生果腐病，俗称烂果病，最早在美国发现，之后世界许多国家相继报道，在我国山东、河北、吉林、河南等地发生，危害严重，尤其是重茬地块，有逐年加重趋势［1］。一般发病田产量损失达15%左右，重病田可致绝收。国内外研究表明，花生果腐病是由多种病原菌侵染引起的。病原菌包括丝核菌（Rhizoctoniasp.）、腐霉菌（Pythiumsp.）、冬青丽赤壳菌（Sclerotiumsp.，有性阶段）、侵脉新赤壳菌（Neocosmosporasp.，有性阶段）、镰刀菌（Fusariumsp.）等［2］。不同地域和环境条件下病原菌种类存在较大差异，不同的病原菌引起花生果腐病的症状不同［2］。我国花生果腐病以真菌土传病菌镰刀菌侵染为主，腐霉菌次之。该病害主要危害果柄和荚果，罹病果表现出不同程度的褪色，从浅表变褐色到整个荚果壳完全变成黑色。不同发育阶段的荚果均可受害，果仁也表现出不同程度的腐烂。果柄与荚果的结合部罹病后果柄与荚果结合不牢固，不利于机械化收获，加大产量损失［1-2］。但是病原菌致病机制及花生抗病机制相关基础研究进展缓慢，不同地域、不同环境下（土壤类型、温度、湿度），花生果腐病原菌的侵染及致病力也存在很大差异。

安阳市内黄县、滑县是河南省花生主产区，花生常年种植面积在7 万hm2左右，近年来随着花生种植机械化水平和相对收益率的不断提高，农民种植花生的积极性在不断提高，种植面积也随之增大。从2018 年开始，随着安阳市花生种植面积的逐年扩大，花生果腐病有逐年蔓延流行发生的趋势，目前已经成为安阳地区花生主产区的主要土传病害之一。2020 年，内黄县高堤乡、二安乡等地发生了花生果腐病，严重情况下，发病率高达50%以上，造成了大幅度减产。花生果腐病的防治比较困难，目前尚缺乏有效的治理措施。该病的发生不仅影响花生产量和品质，也影响农民种植积极性，对安阳地区花生产业发展构成了严重威胁。为了最大限度降低花生果腐病危害，实现防病增产，安阳市农业科学院花生团队在承担安阳市重点研发与推广专项——高产、抗果腐病花生新种质创制与新品种选育任务基础上，从2019 年开始连续3 a 对安阳市内黄县的花生果腐病进行调查和取样，对致病病原菌进行鉴定，同时对花生果腐病发生动态进行调查研究，为防治花生果腐病提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料采集

鉴定果腐病材料样本均从内黄县二安镇、高堤乡、井店镇、城关镇这几个乡镇选取，种植品种为豫花37、濮花28、安花3 等品种。

1.2 病原菌分离鉴定

病原菌分离应用单孢分离法，并应用柯赫氏法则进行验证。

1.2.1 病原菌分离 将患果腐病材料样本用清水冲洗3 h，用无菌水浸泡冲洗5 次，放置于无菌滤纸吸干水分后，在染病与健康交界处带果仁剪取4 mm×6 mm的染病组织。然后用次氯酸钠消毒1 min，再用无菌水漂洗后，用无菌滤纸吸干水分，立即放置于琼脂培养皿中，待菌丝自然长出后，切取菌丝尖端放置于马铃薯葡萄糖培养基，移放入25 ℃恒温培养箱中培养6 d，保持光照12 h、黑暗12 h 条件，待菌落自然形成后，统计各菌落数，经分离纯化后作为供试菌株。

1.2.2 病原菌鉴定 将分离纯化后的供试菌株移植到马铃薯葡萄糖培养基上，放入25 ℃恒温箱黑暗环境条件下培养，4 d 后供试菌株长出菌丝，在光照12 h、黑暗12 h 的条件下培养8 d，每天观察记录菌丝生长状况和菌株的形态特征及分生孢子形态。利用十字交叉法测量菌落直径。采用《真菌鉴定手册》［3］中的方法进行鉴定，确定病原菌种类。

1.2.3 不同氮源条件下病原菌落生长直径变化测定 利用相同量的硫酸铵、草酸铵、硝酸铵、酵母膏、花生饼、蛋白胨作为氮源，均以查彼克培养基为基础对照，置于27 ℃恒温箱培养6 d。采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.4 不同碳源条件下病原菌落生长直径变化测定 利用相同量的葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、乳糖、麦芽糖作为碳源，均以查彼克培养基为基础对照，置于27 ℃恒温箱培养6 d。采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.5 病原菌丝最高致死温度测定 将6 个离心管中均盛入3 mL 灭菌水，然后每个离心管中均放入4枚4 mm 的菌丝块，恒温水浴箱分别设置50、55、60、65、70 ℃，共5 个温度处理，加热1 min 后，放入菌丝块，再分别加热5 min 和10 min 后，取出菌丝块，移植到马铃薯葡萄糖培养基上，放入25 ℃恒温箱培养6 d，调查菌丝死亡情况，确定菌丝最高死亡温度。

1.2.6 病原菌落在不同pH 值下的生长直径测定 马铃薯葡萄糖培养基用1.2 mol/L NaOH 无菌溶液和1.2 mol/L HCl 无菌溶液调节pH 值，分别将pH 值设为5～10，根据每个pH 值制作对应的马铃薯葡萄糖培养基平板，每个平板均接种7 mm 菌落块，放入25 ℃恒温箱黑暗环境条件下培养8 d。采用十字交叉法测量菌落直径。

1.3 花生果腐病发生动态调查

2019—2021 年的5 月中上旬至9 月中上旬，连续3 a 在安阳市最具代表性的花生主产区内黄县城关镇陈营村、二安镇李草坡村等8 个村开展花生果腐病发生动态调查。调查方法为随机选取10 户裸地花生种植地块，采用单对角线式取样法，每点取样100 株，观察记载病株数，计算病株率：病株率=病株数/调查总株数×100%。调查从出苗开始到收获结束，调查周期为15 d。

花生果腐病病情指数调查方法为首先采用单对角线五点取样法对花生果腐病病株进行调查，每点调查100 株，然后统计发病株数，根据发病株数进行病害分级。计算病情指数：病情指数=∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级值）×100［4］。

1.4 数据分析

数据处理及统计分析采用Excel 2019 和SPSS 12.0 软件进行。

2 结果与分析

2.1 病原菌种类鉴定

通过对内黄县二安镇、高堤乡、井店镇、城关镇采集到的60 个果腐病典型病株纯化分离病原菌，共得到195 个菌落。在显微镜下观察，菌丝颜色呈灰白色至淡黄色，呈疏松状；有2 种形态不同的分生孢子，大型分生孢子形状为稍弯曲镰刀形，有5 个左右隔膜；小型分生孢子形状为卵圆形至长椭圆形，生长在分生孢子梗上，呈弯曲或直状，有1 个隔膜或无隔膜。根据菌落形态特征鉴定出4 种不同的病原菌（表1）。由表1 可知，茄镰刀病原菌占比71.8%，群结腐霉病原菌占比18.5%，曲霉病原菌占比1.0%，链格孢病原菌占比8.7%。

表1 病原菌种类鉴定结果 个

利用盆栽回接法培养病原菌，共出现16 个患病花生果壳样品。分离物经过单孢纯化后，利用孢子悬浮液分别接种到花生荚果和花生苗上，花生荚果有9 株出现与田间发病类似病症，花生苗均未产生症状。在分离的病原菌中，茄镰刀菌致病性最强，在接种发病的花生染病与健康交界处带果仁剪取染病组织，分离纯化病菌形态与接种菌株形态类似。病原菌培养结果显示，茄镰刀病原菌占81.6%，群结腐霉病原菌数占52.8%，曲霉病原菌占0%，链格孢病原菌数占4.8%。分离鉴定结果表明，安阳市内黄县花生果腐病病原菌主要是茄镰刀菌和群结腐霉菌。

2.2 不同氮源对病原菌落生长直径的影响

病原菌菌落在不同氮源条件下生长直径变化有明显差异，其中菌落直径最大的氮源为酵母膏，达到60 mm，其次为蛋白胨，菌落直径长为57 mm，酵母膏和蛋白胨为最适宜菌丝生长氮源。草酸铵组的菌落生长直径最小，为21 mm，其次是硫酸铵，菌落生长直径为25 mm，草酸铵和硫酸铵为最不适宜菌丝生长氮源。除对照组外，菌丝生长旺盛，均能覆盖培养基。对照组的菌丝生长直径为52 mm，生长稀疏，菌丝不能覆盖培养基（图1）。

图1 不同氮源对病原菌落生长的影响

2.3 不同碳源对病原菌落生长直径的影响

病原菌菌落在不同碳源条件下生长直径变化不明显，菌落生长直径最长的碳源为乳糖，达到69 mm，乳糖为最适宜碳源，其次为蔗糖，菌落生长直径为65 mm，麦芽糖、葡萄糖、木糖组的菌落生长直径分别为64、62、60 mm，果糖组菌落生长直径最小，为58 mm。不同碳源对菌丝生长直径影响较小，菌丝生长浓密，培养基被菌丝完全覆盖。对照组菌落生长直径为63 mm，菌丝生长稀疏，不能完全覆盖培养基（图2）。

图2 不同碳源对病原菌落生长的影响

2.4 病原菌丝最高致死温度

将病原菌菌丝分别在50、55、60、65 ℃处理5 min后，均能继续生长，处理10 min 后，也能正常生长；在67 ℃5 min 后，停止生长。可见，致死条件为67 ℃5 min。

2.5 不同pH 值对病原菌落生长直径的影响

pH 值为7 时，菌落生长直径最大，达到82 mm；pH 值为10 时，菌落生长直径最小，为65 mm；pH 值在5～7 时，菌落生长直径无明显差异（图3）。

图3 不同pH 值对病原菌落生长直径的影响

2.6 花生果腐病发生动态

通过试点村花生田间观察，花生果腐病病株呈片状发生，病株叶片出现类似花生褐斑病的褐色椭圆形斑点，而正常的花生植株叶片呈绿色。从开花期以后果腐病逐渐加重发生，每年7 月15 日至8 月15日，如遇雨水过大，田间密度过大，在高温高湿环境下致病病原菌极易侵害荚果引起腐烂。砂土地和偏干旱地块发病较轻，只有果壳出现黑褐色病斑，如果后期湿度过高果腐病也会严重发生，整个荚果变黑腐烂，重茬连作地块地下害虫严重也会导致果腐病重度发生。荚果侵染症状为果壳刚开始出现褐色不规则小斑点，随着病情加重发展成暗黑褐色大病斑，最后整个荚果完全变黑腐烂。果腐病发病较轻的荚果特征为果仁瘦小、发硬、停止发育，种皮色呈浅灰色；果腐病发病严重的荚果特征为果柄呈黑褐色，与荚果连接松散，收获时极易脱落，荚果果仁与果壳全部腐烂有恶臭味，没有任何利用价值。

安阳市内黄县花生果腐病发生动态调查结果（图4）显示，2019 年果腐病发生相对较轻，2020 年和2021 年果腐病发生较重，连续3 a 调查的果腐病发生动态基本趋同。2019 年，果腐病发病率最高为14.60%，整体发病较轻，病情指数为15.72；2020 年，果腐病发病率最高为18.90%，病情指数为19.84；2021年，果腐病发病率最高为24.80%，病情指数为26.79。

从图4 可以看出，在花生荚果尚未形成的苗期、开花期、下针期均未出现花生果腐病，在7 月1 日结荚初期发现有零星果腐病感染病株；7 月8 日后果腐病病情开始逐步蔓延发生，到8 月10 日果腐病发生已经比较严重，病情指数和发病率明显增高；到8 月20 日成熟收获期，果腐病发生达到峰值。

图4 安阳市内黄县花生果腐病发生动态

3 结论与讨论

茄镰刀菌是多种植物及动物的致病菌，在自然界中广泛存在，能使植物发生根部腐烂、植株枯萎等症状，对植物生长发育造成严重不利影响。茄镰刀菌是花生果腐病的主要致病病原之一［5］。

本研究通过对安阳市内黄县的花生果腐病病原进行分离、纯化、回接鉴定，证明花生果腐病首位致病病原菌是茄镰刀菌，次致病病原菌是群结腐霉菌。病株地上植株茎、枝、叶色呈绿色，生长正常，茎基部刚开始染病时出现褐色水渍状病斑，维管束颜色也变成褐色。荚果外壳在果腐病侵染初期会出现大小不规则深褪色病斑，随着果腐病发展加重荚果外壳呈铁锈色，果仁逐渐干瘪，直至荚果完全变黑，果柄脱落，果仁完全腐烂丧失利用价值。

本研究结果表明，安阳市内黄县花生在7月1 日结荚初期出现零星果腐病病株，在7 月8 日后果腐病病情开始逐步蔓延发生，到8 月10 日果腐病病情指数和发病率明显增加，到8 月20 日成熟收获期时果腐病病情达到顶峰。