酸菜中乳酸菌生长曲线、产酸性能及抑菌性能探究

袁先铃，周莺茹，郑连强，雷鸣，王俊丁

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.四川省远达集团富顺县美乐食品有限公司，四川 自贡 643200）

四川酸菜主要是以芥菜为加工原料，通过优势菌群乳酸菌以厌氧为主发酵而成的一种发酵类食品[1]，是一种佐餐菜肴，也是一种辅料[2]。乳酸菌从来源上可分为动物源乳酸菌和植物源乳酸菌[3]，从发酵过程上可分为异型乳酸发酵菌和同型乳酸发酵菌[4]。乳酸菌能在酸性较强的条件下生长并能在盐水浓度较高的环境中繁殖，但乳酸菌本身只有肽酶，合成氨基酸、核酸、维生素的能力极低，所以在乳酸菌的生长环境中需要加入氨基酸、维生素等生长因子[5]。杨静等[6]研究得出植物乳杆菌在恒温培养6 h～8 h后进入对数生长期，18 h后进入稳定期。类干酪乳杆菌在4 h进入对数期，发酵30 h后进入稳定期[7]。比较菌株的生长速率和产酸量可以反映乳酸菌的发酵性能[8]，罗强等[9]从自然发酵泡菜中筛选出9株产酸能力较强的菌株。乳酸菌可以分泌多种抑菌物质，主要包括有机酸、细菌素、过氧化氢等[10]。乳酸菌能够产生有机酸，而有机酸的存在会导致环境pH值降低，进而抑制腐败菌的生长[11]。郝湘妹[12]研究抑制霉菌乳酸菌的筛选、特性及应用时，发现pH值为中性的发酵上清液的抑菌活性显著下降（p＜0.05）。

发酵菌株的产酸性能和抑菌性能对酸菜的风味有重要影响。从温度和含盐量两个方面探究对菌株生长的影响，通过探究乳酸菌发酵液在32 h内的pH值变化规律筛选出产酸速率最快的菌株，采用牛津杯琼脂扩散法对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌指示菌进行抑菌试验，筛选出对不同指示菌抑制效果比较好的菌株，以期获得理想的人工接种乳酸菌菌株，从而显著缩短酸菜发酵周期，改善酸菜的品质[13-14]，为实现高品质规模化工业化发酵生产提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

目标菌（食品乳杆菌、植物乳杆菌、类干酪乳杆菌菌株）：从自然发酵酸菜中分离所得；指示菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌）：北京保藏生物科技有限公司。

MRS液体培养基：蛋白胨1.0 g、酵母膏0.5 g、牛肉膏1.0 g、磷酸氢二钾0.2 g、柠檬酸二铵0.2 g、乙酸钠0.2g、葡萄糖2.0g、吐温80 0.1mL、MnSO4·4H2O 0.025g、MgSO4·7H2O 0.058 g、蒸馏水 100 mL，pH6.2～6.4[5]。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂 15 g～25 g、水 1 000 mL、pH7.4～7.6。

LB固体培养基：胰化蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、琼脂粉 15 g、pH7.0。

1.2 仪器与设备

SHP-250E生化培养箱：上海培因试验仪器有限公司；SW-CJ超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；Legend Micro17离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生长趋势的测定

选择3种目标菌分别在MRS液体培养基中进行扩增培养，并将2%的相应菌液接种到MRS液体培养基中。将菌液置于37℃恒温生化培养箱中培养52 h，每隔4 h测定1次菌液在600 nm处的吸光度，平行测定3次。

1.3.2 培养温度对菌株生长的影响

以2%的接种量将菌液接种于50 mL MRS液体培养基中，分别在 20、23、26、29、32、35、38 ℃培养 24 h，并在600 nm处测定吸光度，平行测定3次[15]。

1.3.3 含盐量对菌株生长的影响

以2%的接种量将菌液接种于NaCl浓度分别为0%、2%、4%、6%、8%和10%的MRS液体培养基中，于35℃生化培养箱中培养24 h，并在600 nm处测定吸光度，平行测定3次[15]。

1.3.4 乳酸菌的产酸性能测定

以2%的接种量将3株菌株接入到装有2 mL MRS液体培养基的离心管中 37 ℃培养 0、8、16、24、32 h，分别测发酵液pH值，每株菌平行测定3次，结果取平均值[16]。

1.3.5 乳酸菌的抑菌性能研究

指示菌以金黄色葡萄球菌为例，大肠杆菌和沙门氏菌试验方法参照金黄色葡萄球菌。配制固体金黄色葡萄球菌培养基，121℃灭菌15 min后取出倒平板，待凝固后于4℃保存备用。

金黄色葡萄球菌菌悬液的配制：将金黄色葡萄球菌接种于灭菌后的LB液体培养基中，放置在37℃恒温培养24 h后取出放入4℃冰箱备用。

将2%的食品乳杆菌、植物乳杆菌和类干酪乳杆菌3株菌的发酵液接种培养24 h后于4℃，12 000 r/min离心10 min，取发酵上清液4℃保存备用。取200 μL稀释后的指示菌液于相应的指示菌培养基上并均匀涂布在平板表面，轻轻放上牛津杯（牛津杯既不能集中放，也不能放在平板的边缘，均匀放置）；用移液枪向牛津杯中加入100 μL发酵上清液，对照用不加菌株的空白发酵液。放置在37℃恒温培养箱中培养18 h后观察抑菌圈大小，用游标卡尺测量抑菌圈大小，每株菌平行测定3次，结果取平均值，比较3株菌的抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 生长曲线的绘制

2.1.1 菌株生长曲线

食品乳杆菌、植物乳杆菌和类干酪乳杆菌菌株生长曲线如图1所示。

图1 菌株生长曲线Fig.1 Growth curves of strains

由图1可知，食品乳杆菌在12 h后进入对数期，在24 h后进入稳定期，在36 h后进入衰亡期；植物乳杆菌在8 h后进入对数期，20 h后进入稳定期，在44 h后进入衰亡期；类干酪乳杆菌在8 h后进入对数期，24 h后进入稳定期，在40 h后进入衰亡期。由此可见，植物乳杆菌和类干酪乳杆菌的对数期比食品乳杆菌的对数期及稳定期更长，更适合作为酸菜添加菌株。

2.1.2 培养温度对菌株生长的影响

培养温度对食品乳杆菌、植物乳杆菌和类干酪乳杆菌菌株生长的影响如图2所示。

图2 培养温度对菌株生长的影响Fig.2 Effect of culture temperature on the growth of strain

温度通过影响乳酸菌细胞中酶的活性，从而影响乳酸菌菌株的生长。由图2可知，随着培养温度的升高，乳酸菌生长得越好，均在35℃时生长状态最佳；但当培养温度超过35℃时，3株菌的生长均受到了抑制。Dong等[17]对乳酸菌株筛选研究表明温度越高，乳酸菌细胞数量和乳酸产量越大，但在32℃～35℃时生长最好，乳酸产量最高，并且随着温度继续升高，生长繁殖受到抑制，乳酸产量下降。

2.1.3 菌株耐盐试验

食品乳杆菌、植物乳杆菌和类干酪乳杆菌菌株耐盐试验结果如图3所示。

图3 菌株耐盐试验Fig.3 Salt tolerance test of strain

由图3可知，随着含盐量的增加，3株菌的生长繁殖均受到了抑制，在低浓度时，抑制作用不明显，而在高浓度时几乎不生长，综合发酵酸菜需要一定含盐量的情况，含盐量控制在0%～8%时，乳酸菌的活性最好。黄海钦等[18]发明一种老坛酸菜的加工工艺方法，其酸菜含盐量为7%～9%时比自然发酵工艺腌制出来的酸菜酸度更为明显，风味更佳，食用口感更好。

2.2 乳酸菌的产酸性能

食品乳杆菌、植物乳杆菌和类干酪乳杆菌菌株的发酵液在0～32 h内的pH值变化如图4所示。

图4 乳酸菌发酵液pH值变化Fig.4 pH levels of fermentation broth of lactic acid bacteria

由图4可以得出，3株菌株发酵液的pH值整体变化呈下降趋势。在0～8 h之间pH值下降速度最快，此时3株菌在对数生长期代谢旺盛，产酸速率最快，8 h～24 h之间pH值下降速度减缓，此时部分乳酸菌菌株已进入稳定期，营养物质变少，24 h～32 h之间pH值下降更慢，这是因为大部分乳酸菌已进入稳定期，营养物质基本消耗殆尽，酸类等代谢产物大量累积，这在一定程度上又抑制了酸的形成。0～24 h之间pH值下降速率最快的菌株是植物乳杆菌，其中植物乳杆菌和类干酪乳杆菌发酵液24 h后的pH值最低，分别为3.23和3.24，pH值下降速率最快。因此植物乳杆菌和类干酪乳杆菌的产酸能力最强。菌株的产酸能力越强，加入到酸菜进行发酵，发酵时间越短。综上，选择植物乳杆菌和类干酪乳杆菌作为添加菌株。

2.3 乳酸菌的抑菌性能结果

食品乳杆菌、植物乳杆菌和类干酪乳杆菌菌株对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种指示菌的抑菌效果如图5所示。

图5 乳酸菌对指示菌抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of lactic acid bacteria on indicator bacteria

如图5所示，3株乳酸菌抑制大肠杆菌效果大小顺序：植物乳杆菌＞类干酪乳杆菌＞食品乳杆菌，抑菌圈直径分别为16、15、12 mm；对金黄色葡萄球菌抑菌效果大小顺序：植物乳杆菌＞类干酪乳杆菌＞食品乳杆菌，抑菌圈直径为17、14、13 mm。对沙门氏菌抑菌效果大小顺序：类干酪乳杆菌＞植物乳杆菌＞食品乳杆菌，抑菌圈直径为20、18、14 mm。从数据分析得出同一指示菌对不同乳酸菌的抑制效果不相同，这和赵媛媛[16]研究乳酸菌对不同指示菌的抑制的结果相符。其次，植物乳杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌的抑制效果较好，抑菌圈直径几乎都在16 mm～18 mm；从这一数据可以得出：同一菌株对不同指示菌的抑制效果不同[19]。指示菌有阳性菌和阴性菌，而3株乳酸菌株都是阳性菌株，一般来说，大多数乳酸菌仅仅抑制亲缘关系相近的菌种或多数革兰氏阳性细菌[20]，也有研究表明，阳性菌株对阳性指示菌的抑制作用大于对阴性指示菌的抑制作用。所以植物乳杆菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果好于对沙门氏菌。

植物乳杆菌具有较强的抑菌作用，如陆春波等[21]确定了植物乳杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌具有较强的抑制作用；Dong等[17]研究发现植物乳杆菌能产生抑菌物质乙酸、乳酸和丙酸等有机酸。植物乳杆菌能产生植物乳杆菌素，该细菌素在pH值较低的酸性环境中有较强的抑菌活性，高压处理其发酵上清液后仍保持良好的抑菌活性[12]。植物乳杆菌具有抑菌作用，酸菜中添加植物乳杆菌就能增加酸菜中抑菌物质含量，而酸菜中含有的乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸有助于酸菜的抑菌性能。

综上所述，对3种指示菌抑制效果均比较好的菌株是植物乳杆菌和类干酪乳杆菌。这两株乳酸菌对3种指示菌都具有良好的抑菌能力，同时这两株菌能有效改善酸菜的腐败，对酸菜的风味物质的形成具有重要意义。由此，选择植物乳杆菌和类干酪乳杆菌作为发酵酸菜的优良菌株。

3 结论

对食品乳杆菌、植物乳杆菌和类干酪乳杆菌这3株乳酸菌，进行生长繁殖的测定试验，结果发现3株菌的pH值均呈下降趋势，但植物乳杆菌和类干酪乳杆菌的pH值较食品乳杆菌低，所以选择植物乳杆菌和类干酪乳杆菌作为pH值下降快、产酸速率高的菌株。通过抑菌特性试验，发现植物乳杆菌和类干酪乳杆菌对3种指示菌的抑菌圈直径均大于食品乳杆菌，认为这两株菌抑菌能力较好。综合产酸特性和抑菌特性，筛选植物乳杆菌和类干酪乳杆菌两株菌作为人工添加菌株，可进行深入研究。但本研究针对的是常见3种腐败菌和致病菌，下一步可以增加指示菌的种类，对乳酸菌抑制腐败菌和致病菌的物质和原理进行深入探究。