血红素加氧酶-1降低RAW264.7巨噬细胞炎症因子表达的线粒体机制研究

高新跃, 冯羽敬, 包 蓉, 黄朝朝, 贡 瞻, 周宇杰

(上海市浦东新区浦南医院 麻醉科, 上海, 200125)

炎症是机体抵御外来病原体感染发生各种病理反应的中心环节，会造成组织细胞损害[1]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)主要由单核巨噬细胞分泌，可诱导炎症级联反应和巨噬细胞表达白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)，在免疫细胞功能调节中有重要作用，其中IL-1β是反映全身和局部炎症反应的重要物质[2]。相关研究[3]表明，过度的炎症反应会导致线粒体功能受损，生成大量活性氧(ROS), 加重炎症反应，严重时还会导致线粒体凋亡和细胞死亡。血红素加氧酶-1(HO-1)是体内重要的诱导型抗氧化酶，正常情况下表达极少，在内毒素脂多糖(LPS)、炎症因子、ROS等刺激下可大量表达[4]。相关研究[5-7]发现, RAW264.7巨噬细胞可表达HO-1, 抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的释放。但HO-1抑制炎症反应是否与线粒体功能有关目前尚未完全阐明，鉴于此，本研究分析了HO-1抑制TNF-α、IL-1β、ROS合成与线粒体分裂的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

RAW264.7巨噬细胞(批号FH0318), 购自富衡生物科技有限公司; LPS(批号HY-D1056)、HO-1诱导剂血红素(Hemin, 批号HY-19424)、HO-1拮抗剂锌原卟啉-IX(ZnPP-IX, 批号HY-101193)、线粒体自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA, 批号HY-19312)、线粒体自噬促进剂雷帕霉素(RAPA, 批号AY-22989), 购自美国NCE生物公司; HO-1抗体(批号AF5393)、IL-1β抗体(批号AF5103)、TNF-α抗体(批号AF7014)、购自中国Affinity生物公司; 自噬标志物微管相关蛋白1A/1B轻链3B(LC3B, 批号AF5402), 购自美国Proteintech生物公司; ROS检测试剂盒(批号S0033S)、Western及IP细胞裂解液(批号P0013)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量分析试剂盒(增强型)(批号P0010)，购自中国碧云天生物技术公司。

1.2 实验分组与处理

取对数生长期的RAW264.7细胞进行培养，将其随机分为空白对照组(C组)、LPS造模组(CL组)、Hemin+LPS组(HL组)、ZnPP-IX+LPS组(ZL组)、3-MA+LPS组(ML组)、RAPA+LPS组(RL组)，共计6组。C组: 继续培养，不做任何处理; CL组: 加入1 μg/mL LPS孵育; HL组: 加入30 mol/L Hemin孵育1 h后，加入1 μg/mL LPS孵育; ZL组: 加入5 μmo1/L ZnPP-IX孵育0.5 h后，加入1 μg/mL LPS孵育; ML组: 加入5 mmo1/L 3-MA孵育0.5 h后，加入1 μg/mL LPS孵育; RL组: 加入12.5 nmo1/L RAPA孵育0.5 h后，加入1 μg/mLLPS孵育。各组于培养后LPS孵育48 h后，进行相关指标的测定。

1.3 蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白表达量

采用凝胶电泳法进行HO-1、IL-1β、TNF-α、线粒体动力蛋白1(DRP1)、受体裂变蛋白1(FIS1)、LC3B、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)检测，使用Image J软件分析各组目标条带灰度值与GAPDH灰度值的比值代表HO-1、IL-1β、TNF-α、LC3B、FIS1、DRP1的表达量。

1.4 ROS检测

使用ROS检测试剂盒进行测定，采用荧光倒置显微镜观察并拍照，以Image J 软件分析ROS含量。

1.5 统计学分析

2 结 果

与C组比较，另5组的HO-1、LC3B、ROS表达量均增加, DRP1表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与C组比较, CL组、ZL组和ML组的FIS1表达量均增加, HL组、RL组的FIS1表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与C组比较, HL组的IL-1β、TNF-α表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与CL组比较, HL组的LC3B表达量降低, ZL组、ML组和RL组的LC3B表达量均增加，差异有统计学意义(P<0.05); 与CL组比较，HL组的TNF-α、IL-1β表达量均降低, RL组的IL-1β表达量增加、TNF-α表达量降低, ML组的TNF-α、IL-1β表达量增加，差异有统计学意义(P<0.05); 与CL组比较, HL组、RL组的ROS表达量降低, ZL组、ML组的ROS表达量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。HL组的TNF-α、IL-1β、DRP1表达量低于另5组, HO-1表达量高于另5组，差异有统计学意义(P<0.05); RL组的FIS1表达量低于HL组, LC3B表达量高于HL组，差异有统计学意义(P<0.05)。RL组的IL-1β、TNF-α、FIS1、DRP1、ROS表达量低于ML组, LC3B表达量高于ML组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 6组HO-1、IL-1β、TNF-α、LC3B、FIS1、DRP1和ROS表达量比较

3 讨 论

控制过度的炎症反应，对于减少炎症相关疾病和组织细胞损伤意义重大[8]。本研究中，实验采用的RAW264.7巨噬细胞是目前检测抗炎症反应影响的最常用细胞[9]。离体实验和在体研究[10-11]证明, Hemin作为一种活性蛋白，可诱导HO-1大量表达，生成有活性的代谢物质和重要的分子信号通路，显著提高细胞和机体的存活率。本研究结果显示，与C组、CL组、ZL组比较，HL组HO-1表达量增加, IL-1β、TNF-α、ROS表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05), 表明HO-1大量表达可减轻炎症反应和氧化应激，与相关研究[12]结论一致。

线粒体自噬是维持细胞内环境稳定的重要机制之一，可以消灭各种外来有害物质和抑制氧化应激、炎症反应、衰老和死亡等，其重要标志是细胞内出现自噬小体[13]。线粒体功能改变，往往表现为DRP1和FIS1增加。线粒体动力学平衡，包括分裂/融合平衡[14]。相关研究[15]指出，FIS1作为一种重要的受体，可协助DRP1完成裂变事件。本研究结果显示, RL组LC3B表达量高于C组、CL组、ML组, FIS1、DRP1表达量低于C组、CL组、ML组, IL-1β、TNF-α表达量低于ML组, ROS表达量低于CL组、HL组、ML组，差异有统计学意义(P<0.05), 表明线粒体自噬有利于减轻氧化应激和炎症反应。本研究还发现, HL组的FIS1表达量低于ML组、高于RL组，差异有统计学意义(P<0.05), 说明HO-1可以抑制线粒体分裂。

相关研究[14]证明, HO-1可抑制炎症反应和氧化应激，调节线粒体分裂/融合平衡过程，减少细胞凋亡的发生。本研究发现，HO-1和线粒体自噬均有利于减轻炎症反应和氧化应激，说明HO-1有保护线粒体功能的作用。

综上所述, HO-1可抑制线粒体分裂而降低炎症因子表达，且效果优于线粒体自噬。但本研究仅观察了FIS1的变化，并未综合研究分裂/融合平衡的变化，说服力可能较弱，且仅从HO-1抑制LC3B、FIS1表达方面难以证明HO-1可以调节线粒体功能，进而抑制炎症反应，未来还需进一步深入研究。