人血清PCT直接化学发光免疫分析方法的建立及性能评价①

杨进波 焦 蓉 孙 莉 曹 琳 武军驻 童 伟

（湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院，襄阳 441000）

降钙素原（procalcitonin，PCT）是降钙素前体，分子量约为13 kD，由甲状腺C 细胞分泌形成，包含降钙蛋白、降钙素与N 残基片段［1］。研究表明，PCT 在诊断脓毒症、系统性炎症反应综合征与急性呼吸窘迫综合征等疾病时具有较高的敏感性与特异性［2］。PCT作为一项重要炎症指标，在疾病辅助诊断治疗、指导抗生素使用方面具有重要价值［3］。PCT 的半衰期一般为25～30 h，相比IL-6、TNF-α 等半衰期只有数分钟至几小时的炎症因子，PCT稳定性更好；对比传统验证指标C-反应蛋白（CRP），患者血浆PCT 浓度在升高2 h 后就可用分析仪检测，而CRP 在炎症过程开始8～12 h后才能检测出来［4-5］。

PCT 作为炎症指标在医院各大科室应用广泛，目前许多医院检测PCT 以荧光免疫层析法为主，该方法胜在设备体积小巧，且定量灵敏度远高于同类胶体产品，特别适合科室及小型医院使用［6］。化学发光法虽在灵敏度、准确度、特异性等方面性能优异，但其设备往往非常庞大，对于科室与小型医院并不友好［7］。国产化学发光分析仪器的发展迅速，应市场需求，近几年衍生出面向科室的中小型化学发光仪器，如国赛公司Kemilo POCT 化学发光分析仪、万孚公司POC 全自动磁微粒化学发光仪以及科斯迈公司SMART 500 全自动化学发光免疫分析仪等。这些仪器兼具体积小与化学发光平台性能出众的特点，其中科斯迈SMART 500 仪器为全开放式系统，可直接设置各类参数进行调试，本研究选择该设备作为研究设备，根据PCT 双抗体夹心法原理成功建立人血清PCT 直接化学发光免疫分析方法，对该方法各项参数进行优化，并与目前医院正在稳定使用的荧光免疫检测系统进行相关性比对。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清标本 158 份不包含抗凝剂的空腹血采集自襄阳市第一人民医院，常温静置20～40 min，待血液完全凝固后以3 000 r/min 离心20 min，收集上清液即为血清，保存至-20 ℃以下待用。所有标本采集于2020年11月至12月。

1.1.2 主要试剂与仪器 配对PCT 捕获抗体与检测抗体均购自金斯瑞公司（Ab-1：克隆号16A1、IgG1亚类；Ab-2：克隆号12C5、IgG2b 亚类；Ab-3：克隆号E72、IgG1 亚类）；重组PCT 抗原购自启泰生物（来源：E.coli；分子量16.1 kD）；吖啶酯、牛血清白蛋白（BSA）、ProClin 300 购自Sigma 公司；链霉亲和素磁珠购自重庆博蓝鹰生物技术有限公司；降钙素原检测试剂盒（干式免疫荧光法）购自基蛋公司，医疗器械注册证编号：苏械注准20162401534，批号：P018210025，4～30 ℃密封保存，有效期为18 个月。SMART 500 全自动化学发光免疫分析仪购自科斯迈公司（渝械注准20192220077）；Getein1600全自动荧光免疫定量分析仪购自基蛋公司（苏械注准20142220013）；BY-L600型离心机购自白洋医疗器械公司；冻干机购自四环仪器；移液器购自大龙公司。

1.2 方法

1.2.1 磁微粒试剂的制备 采用含1%BSA 的0.01 mol/L 的Tris 缓冲液（pH=7.4）将链霉亲和素磁珠稀释到0.4 mg/ml，2～8 ℃保存备用。

1.2.2 吖啶酯标记PCT 检测抗体 PBS（pH=7.4）透析置换抗体缓冲体系，调整抗体浓度为1 mg/ml。吖啶酯用无水N，N-二甲基甲酰胺配制成3 mg/ml溶液。取500µl抗体溶液，加入一定量的吖啶酯溶液，室温避光振荡反应40 min，G25 脱盐纯化柱纯化，加入等体积甘油，-20 ℃保存备用。

1.2.3 生物素化PCT抗体制备 PBS（pH=7.4）透析置换抗体缓冲体系，调整PCT 抗体浓度为1 mg/ml。N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯用无水N，N-二甲基甲酰胺配制成5 mg/ml 溶液。将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液按照一定投料摩尔比加入PCT 抗体溶液中，室温反应30～60 min，结束后加入赖氨酸终止反应20 min，脱盐柱除去体系中多余生物素结合物，加入等体积甘油，-20 ℃保存备用。

1.2.4 PCT 校准品制备 PCT 无国家标准品，本研究将PCT 校准品定值溯源至行业公认测量程序（即基蛋公司PCT 免疫荧光检测系统），具体配制与溯源过程如下：准确量取一定量的PCT 抗原，溶于含0.5%BSA 的PBS 缓冲液，制成PCT 校准品浓缩液，Getein1600 全自动荧光免疫定量分析仪校准后标定PCT校准品浓缩液浓度，向含0.5%BSA的PBS缓冲液中分别加入不同量的PCT 校准品浓缩液，制成浓度分别为0、0.5、1.6、7.0、30.0、100.0 ng/ml 的PCT校准品溶液，使用仪器对每个浓度点进行测试，除零校准点外，其他浓度点偏差应在10%范围内。每个浓度点各分装1 ml 于冻存管中，冻干48 h 制备成冻干粉校准品，2～8 ℃保存备用。

1.2.5 检测程序设定 SMART 500 全自动化学发光免疫分析仪设定检测程序，反应杯中加入20µl样本、生物素化PCT 抗体、吖啶酯标记的PCT 抗体，37 ℃恒温孵育15 min 形成生物素-PCT 捕获抗体-抗原-PCT 检测抗体-吖啶酯复合物，加入磁微粒试剂，孵育5 min。磁场吸引复合物，清洗液洗涤，加入100 µl 预激发液、100 µl 激发液。免疫复合物中吖啶酯在2 种试剂作用下形成激发态中间体，激发态回到基态时发出恒定波长可见光，化学发光免疫分析仪传感器可检测发光强度。发光强度与血清PCT浓度在一定线性范围内成正比，四参数Logistic方程拟合后即可计算血清样本中PCT的浓度。

1.2.6 配对抗体筛选 3 株PCT 抗体（Ab-1、Ab-2、Ab-3）分别用生物素、吖啶酯标记，两两交叉配对实验，建立标准曲线评估每对抗体的标曲相关系数r；选取PCT 阳性样本、阴性样本各1份，用初步建立的方法测定阳性样本与阴性样本的仪器发光值比值（P/N），见表1。

表1 配对抗体筛选Tab.1 Matched antibody pairs screening

1.2.7 生物素化PCT 捕获抗体浓度及工作浓度的筛选 采用棋盘实验法。生物素与PCT 捕获抗体进行偶联，分别按照7.5∶1、15∶1、30∶1 的摩尔比偶联（因素A）。每个生物素偶联物的工作浓度分别按照1∶50、1∶100、1∶200 的比例稀释（因素B），采用双因素交叉实验评估校准品拟合的线性及信噪比（S1/S0），见表2。

表2 生物素化PCT捕获抗体浓度及稀释比例选择Tab.2 Selection of biotinylated PCT capture antibody concentration and dilution ratio

1.2.8 吖啶酯标记PCT 检测抗体浓度及工作浓度的筛选 采用棋盘实验法。吖啶酯与PCT 检测抗体标记，分别按照5∶1、10∶1、20∶1的摩尔比标记（因素A）。每个浓度的标记物工作浓度分别按照1∶250、1∶500、1∶1 000 稀释（因素B）。双因素交叉实验评估校准品拟合的线性和信噪比（S1/S0），见表3。

表3 标记物浓度及稀释比例的选择Tab.3 Selection of marker concentration and dilution ratio

1.2.9 反应时间选择 确定生物素偶联PCT 捕获抗体、吖啶酯标记PCT 检测抗体工作浓度，进一步探究最佳的反应时间。设定反应时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min，评估不同时间下校准品的回归曲线，见图1。

图1 不同反应时间校准品相对发光值Fig.1 Relative luminescence value of calibrator under different reaction times

1.2.10 准确度试验 将已标定浓度的PCT 抗原母液稀释至100 ng/ml，浓度记为Xs；取低值血清样本与参考品（抗原母液配制）以9∶1 的体积比混合，分别检测低值血清样本与混合样本，每个样本重复检测3 次，计算检测结果的平均值（X0 与X）。根据公式P=（10X-9X0）/Xs×100%计算出回收率P。

1.2.11 线性试验 接近线性范围上限的高浓度（活性）样品和接近线性范围下限的低浓度（活性）样品混合成至少5 个稀释浓度（xi）（包括下限、中限及 上 限）。即 配 制 浓 度 为0.02、20.01、40.01、60.01、80.00、100.00 ng/ml 的线性参考品，每个稀释浓度测试3 次，分别求出测定结果的均值（yi）。以稀释浓度（xi）对数为自变量，测定结果均值（yi）对数为因变量拟合线性。

1.2.12 空白限试验 用零浓度校准品S0 作为样本进行检测，重复测定20 次，得出20 次测量结果的相对发光值，计算xˉ和s，将xˉ±2s代入校准品曲线公式，即得本方法空白限。

1.2.13 精密度试验 配制浓度分别为0.5 ng/ml和10 ng/ml 的样品，每个实验重复10 次，计算批内精密度；重复3 次实验，以30 次检测结果计算批间精密度。

1.2.14 特异性试验 配制浓度为30 ng/ml 的人钙抑肽（human katacalcin），10 ng/ml的人降钙素（human calcitonin），10 000 ng/ml 的人α-降钙素基因相关肽（human α-CGRP），10 000 ng/ml 的人β-降钙素基因相关肽（human β-CGRP）进行特异性试验。

1.2.15 与干式免疫法试剂盒的比较试验 PCT定量检测试剂与基蛋生物干式免疫法试剂盒分别检测158份临床血清样本，对两组数据进行相关性分析。

1.3 统计学处理 本研究所有数据均采用Excel 2019 分析，样本浓度由化学发光免疫分析仪通过四参数Logistic方程拟合得到，线性回归采用最小二乘法进行直线拟合。

2 结果

2.1 方法学的建立

2.1.1 配对抗体筛选 结果显示，Ab-1 作为捕获抗体，Ab-3 作为检测抗体进行配对，所获得的相关系数r和P/N值结果最好。

2.1.2 生物素化PCT 捕获抗体浓度及工作浓度筛选 随PCT 捕获抗体浓度升高，线性相关系数呈升高趋势。随生物素浓度升高，信噪比降低。因此根据PCT 校准曲线线性与信噪比情况，筛选出最优的偶联条件为：生物素与PCT捕获抗体摩尔比为15∶1，生物素偶联物工作浓度为1∶100，在该条件下线性和信噪比最优，且原料用量较少。

2.1.3 吖啶酯标记PCT 检测抗体浓度及工作浓度筛选 吖啶酯标记PCT 偶联物稀释至1∶500 时信噪比降低，标记物的线性和信噪比达到最优。因此，筛选出的最优偶联条件为：吖啶酯与PCT 检测抗体摩尔比为10∶1。吖啶酯标记的PCT 偶联物的稀释比例为1∶500 时，校准曲线拟合的线性相关系数和信噪比最好，且原料用量较少。

2.1.4 反应时间选择 随着反应时间延长，校准品各个浓度点的相对发光值也随之升高，一定时间后基本达到平衡，为实现临床快速检测，反应时间选择15 min。

2.2 试剂性能评价

2.2.1 准确度 本方法回收率为95.65%，处于85%～115%范围内，满足行业标准中的准确度要求，见表4。

表4 准确度（ng/ml）Tab.4 Accuracy（ng/ml）

2.2.2 线性 PCT 线性回归方程为y=0.981x+0.658 9，R2=0.999 1，各检测结果在（0.02～100）ng/ml范围内相关系数r＞0.99，表明线性范围符合行业标准要求，见图2。

图2 线性范围评估Fig.2 Linear range evaluation

2.2.3 空白限 空白限检测结果表明该试剂盒空白限为0.01 ng/ml。

2.2.4 精密度 批内、批间精密度结果见表5、表6，本检测方法批内精密度分别为5.35%、5.06%（＜8%），批间精密度分别为5.69%、5.44%（＜10%），精密度均优于行业标准要求。

表5 批内精密度（n=10，ng/ml）Tab.5 Intra-run precision（n=10，ng/ml）

表6 批间精密度（n=30，ng/ml）Tab.6 Inter-assay precision（n=30，ng/ml）

2.2.5 特异性 测定30 ng/ml 人钙抑肽、10 ng/ml人降钙素、10 000 ng/ml 人α-CGRP、10 000 ng/ml 人β-CGRP对PCT测定结果的影响，测值均＜0.05 ng/ml，见表7。说明血清中这几种特异性物质对PCT 检测不发生交叉反应。

表7 特异性检测结果（ng/ml）Tab.7 Specific test results（ng/ml）

2.2.6 与干式免疫法试剂盒比较 二者相关性方程为y=1.050 1x+0.228 5，R2=0.948 7，见图3。结果表明本方法与基蛋生物的干式免疫法检测系统相关性较好。

图3 两种试剂盒样本测定结果相关性Fig.3 Correlation of test results of two kits

3 讨论

PCT 通常由甲状腺的滤泡旁细胞（C 细胞）及肠、肺神经内分泌细胞产生［8］。PCT 前体经内源多肽酶的酶切作用形成小分子，能以游离形式存在于血清中，发挥生物学功能［9］。许多临床研究结果表明，机体受细菌性感染后，引起全身炎症反应时，血清PCT 水平显著升高［10-13］。研究发现，临床上PCT的监测对严重细菌感染与脓毒症早期诊断更为适用，可更快速地反映治疗效果。感染性疾病早期诊断中PCT 检测较WBC 计数、C-CRP 白检测及影像学检查具有更好的特异性［14］。PCT作为一种炎症标志物，是诊断感染性疾病的重要依据之一，同时对非感染性疾病也具有一定的指导意义，研究表明机体受到病毒性感染时，可产生免疫应答反应，释放特定细胞因子（如IFN-γ），可降低PCT 表达。由于这一选择性细胞机制，PCT 在辨别细菌性感染与病毒性感染中有重要临床意义［15］。此外，PCT 亦可指导临床经验性的抗生素使用，避免滥用抗生素，同时对疾病的发展过程及转归进行预估。在肾移植排斥反应及感染中，PCT也有重要的诊断意义［16］。

许多研究者对现有国产化PCT 诊断试剂与进口试剂做过比对研究。杨琴等［17］比较了安图生物公司PCT 试剂盒与罗氏公司试剂盒，结果表明二者整体对比相关性良好，在一定程度上可满足医院PCT临床检测需求。李结周［18］对新产业公司化学发光试剂盒与瑞莱公司荧光免疫试剂盒进行了比较，结果表明，瑞莱公司荧光免疫法在便携性方面胜过化学发光法，但准确度与重现性等性能方面不及新产业化学发光法。从比对研究中不难看出，目前市场上PCT 试剂盒的更新迭代主要在于试剂盒的国产化、国产替代进口，优化国产试剂性能达到进口试剂的水准；以及检测方法更新、以性能更优异的化学发光免疫分析法替代酶联免疫、荧光免疫、放射免疫等方法。

基蛋公司检测仪器及PCT 试剂是通过国家相关部门批准临床应用的检测体系，测试结果整体稳定可靠，试剂盒质量过关，故本研究选取该试剂盒比对，结果显示该方法与基蛋生物干式免疫法检测临床样本结果具有良好的相关性（R2=0.948 7），说明该方法与医院原有检测平台差异性小。该方法空白限为0.01 ng/ml，回收率为95.65%，线性范围为0.02～100.00 ng/ml、批内精密度均值为5.21%，批间精密度均值为5.57%，与人钙抑肽、α-CGRP、β-CGRP 基因相关肽无交叉反应，各项性能检测符合行业标准要求。

综上所述，本研究建立的PCT 直接化学发光免疫分析方法兼具小巧、高性能两方面优点，且原料主要为国产，仪器为开放式国产小型化学发光检测设备，在国家不断推动体外诊断试剂国产化的大背景下，该方法可供各大试剂厂家借鉴参考。