兰州地区IL-15、IL-17A和IL-18基因多态性与复发性流产的相关性研究①

李 静 刘 倩 张春花 裴建赢 刘静婷 毛宝宏 （甘肃省妇幼保健院科研中心，兰州 730050）

复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指孕20周前连续2次或以上的自然流产，是一种常见的病理妊娠，影响1%～2%的妊娠女性［1］。其发病因素众多，包括遗传问题、解剖畸形、内分泌异常、凝血等因素，但目前仍有50%患者原因不明，有研究表明其可能与免疫有关。RSA 患者较正常孕妇辅助型T 细胞（helper T cells，Th）百分比增高。Th 通过增加其分泌的细胞因子，加强免疫调节，促进妊娠维持，但免疫调节细胞因子中，特别是白细胞介素（interleukin，IL），一类能在细胞间传递信息、影响妊娠各阶段的具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽，对妊娠结局起到至关重要的作用［2-3］。本研究拟采用病例对照研究方法，运用SNaPshot 技术探讨IL-15 基因rs3806798、IL-17A 基因rs2275913、IL-18 基因rs1946518 和rs187238 位点与RSA发病风险的关系。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 收集2019 年1 月至2020 年8 月于甘肃省妇幼保健院复发性流产门诊就诊的RSA患者150 例设为RSA 组，患者年龄19～41 岁［（29.3±4.0）岁］。纳入标准：流产次数≥2 胎，并且发生于妊娠20周前；无内分泌、感染、解剖、易栓症、夫妻染色体异常；无糖尿病、高血压、风湿免疫性疾病等基础疾病及家族遗传病史；夫妇双方无近亲结婚。对照组为150 例同期体检中心就诊的健康女性，无自然流产史、早产史及妊娠高血压病史，且至少成功分娩1 次1 名健康足月儿，其年龄为20～40 岁（30.0±4.0）岁，两组比较年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究获得甘肃省妇幼保健院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂 引物（上海生工）；Hotstar（Taq Qiagen）；PCR 反应缓冲液、MgCl2（TaKaRa）；dNTP（Generay Biotech）；PCR Marker（New England Biola⁃bs）；SNaPshot Multiplex、5×Sequencing Buffer、HI-DI、GeneScanTM-120（ABI）；SAP（Promega）；EXO-Ⅰ（Epicentre）。

1.1.3 数据来源 查阅HapMap dbSNP 数据库（www. hapmap. ncbi. nlm. nih. Gov）及相关文献，选择IL-15 基因rs3806798、IL-17 基因rs2275913、IL-18基因rs1946518 和rs187238 共4 个位点，3 个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点均满足以下条件：选择RSA 相关SNPs；位点在中国人群最小等位基因频率＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及基因组DNA 提取 采集2 组受试者外周静脉血2 ml 置于EDTA-K2真空抗凝管，根据MagenDNA 提取试剂盒说明书提取白细胞基因组DNA，标记并置于-80 ℃低温冰箱保存备用。

1.2.2 SNaPshot基因分型

1.2.2.1 PCR 扩增引物及SNaPshot 引物设计及合成 参照GenBank 中IL-15、IL-17 和IL-18 基因引物序列查找IL-15 rs3806798、IL-17A rs2275913 及IL-18 rs1946518 和rs187238 共4 个位点的引物序列，运用primer5.0设计引物，见表1。

表1 PCR扩增引物Tab.1 PCR primers in multiplex PCR reaction of this study

1.2.2.2 多重PCR 反应体系（20 µl）包含2×GC-Ⅰbuffer 10µl，去离子水5µl，3.0 mmol/L Mg2+0.4µl，0.3 mmol/L dNTP 2.4 µl，1 U HotStarTaq polymerase 0.2 µl，样本DNA 和多重PCR 引物各1 µl。多重PCR 扩增条件为95 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，反应11 个循环，再次94 ℃变性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，反应24个循环，最后72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。

1.2.2.3 PCR产物纯化 本研究反应体系为17µl，其中PCR 产物为10µl，酶混合液7µl（含生产的5 U SAP和2 U ExoⅠ）；反应条件：37 ℃孵育温1 h，然后75 ℃15 min 以灭活SAP 和ExoⅠ酶，纯化完成后进行单碱基延伸反应，预先混好延伸引物，见表2。

表2 SNaPshot多重单碱基延伸反应延伸引物Tab.2 SNaPshot primer for multiple single base extension reaction

1.2.2.4 SNaPshot 反应 采用ABI PRISM SNaP⁃shot Muhiplex Kit 进行。反应体系为10 µl，其中纯化后多重PCR 产物为2 µl，SNaPshot Mix 5 µl，延伸引物混合1µl，超纯水2µl；反应条件为96 ℃预变性1 min，96 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，反应28个循环，4 ℃保存。

1.2.2.5 SNaPshot 反 应 产 物 纯 化 10 µl 上 述SNaPshot PCR 产物中加入1 U SAP，振荡混匀，37 ℃温育1 h，75 ℃灭活15 min。4 ℃保存24 h 或-20 ℃长期保存。

1.2.2.6 ABI 3730XL 测序仪测序分型产物 取0.5 µl 纯 化 后 延 伸 产 物，与0.5 µl Liz120 SIZE STANDARD 和9µl Hi-Di混匀，95 ℃变性5 min 后上ABI3730XL 测序仪，使用GeneMapper 4.1 软件分析峰图结果。测序与基因分型由深圳华大基因科技有限公司完成。

1.3 统计学分析 对IL-15 rs3806798、IL-17A rs2275913 及IL-18 rs1946518 和rs187238 位点基因型分布进行Hardy-Weinberg 平衡检验，P＞0.05 表示符合平衡检验。采用χ2检验进行组间对比，Logistic二元逐步回归进行多因素分析，统计分析采用SPSS26.0软件进行，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 样本及SNP 质控 IL-15 rs3806798、IL-17A rs2275913、IL-18 rs1946518 和rs187238 这4 个位点在RSA 组和对照组基因型频率进行Hard-Weinberg遗传平衡检验，结果显示所有位点均符合Hard-Weinberg 遗传平衡定律（P＞0.05），说明群体具有代表性，见表3。

表3 4个SNP位点基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验Tab.3 Hardy-Weinberg equilibrium test for genotype distribution of four SNP locus

2.2 4个SNP 位点基因型频率、等位基因频率分布及遗传模式分析 检测RSA 组与对照组IL-15 rs3806798、IL-17A rs2275913、IL-18 rs1946518 3 个SNP 位点基因型频率和等位基因频率分布，差异均无统计学意义（P＞0.05）；对以上3 个SNP 采用非条件Logistic回归模型分析等位基因隐性、显性遗传模式，结果显示RSA 组和对照组差异均无统计学意义（P＞0.05），见表4。但IL-18 rs187238 SNP 位点GG型、CG 型、CC 型在对照组中检出率分别为0、23.3%、76.7%，RSA 组检出率为2.0%、12.0%、86.0%，其构成比差异有统计学意义（χ2=9.256，P=0.010）。通过非条件Logistic回归分析显性、隐性遗传模式，结果显示G 等位型（GC+GG 基因型）与RSA患病风险降低相关（χ2=4.303，OR=0.53，95%CI=0.29～0.97，P=0.038），见表4。但G 等位基因不是RSA的保护性等位基因（χ2=2.275，OR=0.66，95%CI=0.38～1.14，P=0.132），见表4。

表4 两组4个多态性位点基因型和等位基因分布比较及遗传模式分析Tab.4 Comparison of four SNPs's genotype，allele frequency and genetic model analysis in two groups

2.3 连锁不平衡检验和单体型分析 对4 个SNP进行两两间连锁不平衡检验，rs1946518 和rs187238存在完全连锁不平衡（D'=1，r2≥0.152），其余位点两两之间不存在连锁不平衡（图1）。本研究采用SHEsis在线软件进行单体型种类和单体型频率估算［4-5］，以最低频率阈值，即单体型频率＜0.03 不纳入分析范围，本研究4 个位点可构建7 种单体型（AGGC、TAGC、TATC、TATG、TGGC、TGTC、TGTG），其 中TGTG 单体型在RSA 组与对照组分布差异有统计学意义（P＜0.05），同时非条件Logistic 回归分析显示TGTG 单体型是RSA 的保护因素，其OR（95%CI）=0.361（0.158～0.827）［4-5］。但其余各单体型与RSA发病无关（P＞0.05）。见表5。

表5 4个位点单体型频率在RSA组与健康对照组分布比较Tab.5 Comparison of haplotype frequencies of four loci between RSA group and healthy control group

图1 4个SNPs位点的LD图Fig.1 LD map of four SNPs

3 讨论

目前RSA 病因尚不明确，但在大量流产相关因素中，涉及异常免疫反应和IL 的因素尤为引人注目［6］。IL是一类在人体中介导多种免疫反应的免疫调节蛋白，其与相应免疫细胞相互作用，维持母胎免疫平衡。在大量胚胎植入失败或流产相关因素中，IL参与异常免疫反应尤为显著［7］。

最新研究发现IL-15 是由髓样细胞和其他类型细胞表达，免疫调节方面具有治疗潜力的一种多功能分子，其可参与T 细胞反应、激活NK 细胞、协助B 细胞归巢、调节炎症反应，特别在诱导和维持T 细胞应答方面，是免疫治疗方面最具治疗潜力的靶点［8］。目前IL-15 基因多态性与RSA 易感性的关联研究相对较少。WU等［9］对1 015例接受新鲜非供者体外受精周期女性进行前瞻性队列分析，探究IL-15基因rs3806798 A/T 对IVF 结局的影响，结果表明临床妊娠率、胚胎移植率和活产率差异无统计学意义。但TOTH 等［8］研究发现患者胎盘组织中IL-15表达增加可能与胚胎丢失后的植入障碍有关。本研究未发现IL-15 基因rs3806798 位点与RSA 发病的风险增加有关，在多个遗传模式（隐性、显性）下差异无统计学意义。目前IL-15 和RSA 的关系研究较少，但鉴于IL-15 免疫治疗的潜力，需要更多数据去支持其与RSA的关联研究。

IL-17A 是IL-17 家族成员，既往研究表明IL-17在防御病菌、自身免疫病发生等过程中发挥重要作用，近年来逐渐成为医学及免疫学的研究热点。rs2275913 位点位于IL-17A 基因上游区域中核因子激活T细胞（NFAT）结合基序内，NFAT 是IL-17表达的关键调节因子。有研究表明rs2275913 可能影响IL-17转录调控，且可提高IL-17分泌［10］。ZIDAN等［11］采用RFLP 对120 例RSA 患者和120 例无流产史且至少生育1 胎的女性为对照探讨rs2275913 与RSA的关联，发现IL-17A（rs2275913）AA 基因型与RPL风险增加有关，其OR=2.440，95%CI=1.140～5.200，P=0.025。蔺静等［12］研究发现RSA 组该位点A 等位基因频率明显高于对照组，rs2275913位点AG和AA基因携带者RSA 相对危险度分别为GG 等位基因的2.012倍和2.545倍，但在本研究中未发现此种关联（OR=1.229，95%CI=0.654～2.307，P=0.521 6）。本研究与BAHADORI 等［13］和NAJAFI 等［14］的研究结果一致，即IL-17A rs2275913 基因型频率与RPL 风险之间无显著相关性。

越来越多的证据表明IL-18 基因可诱导INF-α，使NK 细胞活化，参与子宫血管的形成和着床，该机制在RSA 的发病中发挥重要作用［15］。人IL-18 基因位于染色体11q22.2～q22.3，有6 个外显子和5 个内含子。转录起始点位于外显子-2 上。IL-18 有2 个启动子区，一个位于外显子-2的6.7 kb上游，另一个位于5'-侧。rs187238（-137G/C）、rs1946518（-607A/G）位于启动子-1 区。在基因启动子转录活性分析中，有研究表明-607A、-137C 等位基因可出现低活动性，因此该位点变化可能导致产物功能增强或减弱，或者带来对某些疾病的易感性，也就是遗传因素变化，这对机体免疫机制研究有积极意义［16］。ZHANG 等［17］回顾了2015 年以前的21 项MEDLINE、EMBASE、OVID SP 和PubMed 的研究，以评估RPL相关IL 的基因多态性。对IL-18 基因的rs1946518、rs187238 多 态 性 进 行Meta 分 析 和 综 述［18-23］，其 中rs1946518 多态性在两种显性和隐性遗传模型下与RSA 均无关：显性模式P=0.310，OR=0.820，95%CI（0.560～1.210）；隐 性 模 式P=0.170，OR=0.730，95%CI（0.470 0～1.140）。但根据rs187238 多态性筛选出来的5项研究，固定效应结果表明，显性遗传模式下，rs187238 多态性与RSA 无关联［P=0.370，OR=1.080，95%CI（0.910 0～1.270）］，但在隐性遗传模 型 下 存 在 关 联 性［P＜0.01，OR=1.690，95%CI（1.240～2.310）］。SALIMI 等［22］的一项meta 研究中发现，rs1946518位点在等位基因显性、隐性、加性及共显性模式中均未发现该位点与RSA 发病相关［18-19，21，24-25］。而rs187238 位点在纯合子模式下［CCvsGG：OR=1.653，95%CI（1.014～2.694），P=0.004］以及隐性模式下［CCvsCG+GG：OR=1.801，95%CI（1.345～2.411），P=0.001］与RSA 风险之间存在显著关联［15，18-21，23，25］。当按种族分层时，在亚洲人群中，rs187238 多态性与RSA 风险间无显著关联。然而，基于基因分型方法进行的亚组分析显示，在TaqMan分型研究组中，rs187238 位点多态性与RSA 风险间的关联呈阳性结果。本研究首次对甘肃地区人群IL-18 基因的rs1946518、rs187238 多态性进行分析，结果显示本研究中RSA 患者rs1946518 位点基因型和等位基因频率与无RSA 史患者差异无统计学意义（P＞0.05），在隐性或显性遗传模式下，利用Logis⁃tic 回归模型分析显示两组间差异均无统计学意义（P＞0.05），与既往研究基本一致［18-19，21，25］；但针对rs187238 的位点研究发现，在隐性遗传模式下［CCvsCG+GG：OR=0.535，95%CI（0.295～0.971），P=0.0380］，结果与我国其他研究不一致［21，23］。YUE等［21］研究未发现该位点CC vs GG+GC 在RSA 患者与对照中存在差异，而王丹等［23］研究表明该位点GC+CC基因型可能是RSA 易感基因型，C 等位基因可能是其发病的遗传易感基因之一。本研究中由于检测出的GG基因型较少，无法计算。

进一步的连锁不平衡和单体型分析发现，rs1946518 和rs187238 存在完全连锁不平衡。TGTG单体型频率在RSA 组及对照组分布差异有统计学意义（P＜0.05），同时非条件Logistic 回归分析显示，该单体型与RSA 发病均有关（OR=0.361，95%CI=0.158 0～0.827 0）。

综上所述，本研究发现rs187238 与甘肃地区RSA 患病有关，但不能完全排除IL-15、IL-17A 基因与中国汉族RSA 疾病的相关性，研究结果与既往研究存在差异，可能与种族地域有关。本研究虽仅选取4 个SNPs，不能完全代表IL-15、IL-17A、IL-18 基因。此外由于本研究样本量较少，且未考虑基因-基因和基因-环境相互作用导致的RSA关联性，因此有必要开展更大样本量、更高质量的研究以进一步验证本研究结论。