慢性牙周炎患者牙龈卟啉单胞菌与Th17/Treg的相关性研究①

于淑琪 苏 旭 徐 洁 陈晓涛 （新疆维吾尔自治区人民医院口腔科，乌鲁木齐 830001）

慢性牙周炎（chronic peridontitis，CP）的发生与 口腔中致病微生物和宿主免疫系统的相互作用密切相关，同时受环境因素影响［1］。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）在促进免疫应答过程中可诱导浆细胞占优势的免疫应答，促进抗原特异性淋巴细胞活化［2］。辅助性T（helper T，Th）细胞是一类未完全分化的T 细胞，各亚群Th 细胞可分泌不同特异性细胞因子，并表达不同转录子，进而调节并影响CP 病理进程。研究证实，相比于健康对照组，CP 患者外周血Th17 细胞占比明显增高，牙周探诊深度与外周血Th17 细胞占比呈正相关［3］。与Th1/Th2 类似，Th17 细胞与Treg 处于平衡关系，在炎症和自身免疫病中相互拮抗。Th17 细胞分泌特异性促炎因子IL-17，促进炎症和自身免疫［4-5］；Treg 通过细胞间直接接触或间接分泌细胞因子抑制T细胞增殖、分化，从而在免疫耐受及机体稳态中发挥负调控作用［6］。本研究旨在探讨不同发展阶段的CP患者外周血Th17/Treg 占比与患者牙龈下菌斑中Pg定植水平是否相关。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象及分组 选取2020年3月至2020年10 月于新疆维吾尔自治区人民医院就诊的CP 患者45 例，其中轻度27 例，中重度18 例，另选取27 例健康志愿者。入组标准：①身体指标良好，符合CP 诊断标准［7］；②全口保留至少10颗牙齿；③过去6个月内未接受任何口腔科治疗且未服用过免疫调节类药物及抗生素；④依从性良好。排除标准：①患有精神系统疾病或存在意识障碍者；②有既往吸烟史者；③免疫缺陷性疾病患者；④哺乳期及妊娠期女性；⑤糖尿病、高血压及具有近期急性感染病史患者。按照患者牙周炎疾病严重程度分为轻、中、重度组［8］：①轻度组：牙龈炎症和探诊出血，牙周袋宽度≤4 mm，附着丧失范围1～2 mm，X线检测显示牙槽骨吸收≤牙根长度1/3；②中度组：牙龈炎症和探诊出血，可有脓，牙周袋宽度≤6 mm，附着丧失范围3～4 mm，X 线片显示牙槽骨吸收或角型吸收达到牙根长度1/3～1/2；③重度：有明显牙龈炎症，牙周袋宽度＞6 mm，附着丧失范围＞5 mm，X线显示牙槽骨吸收＞牙根长度1/2；④健康对照组：全口牙无出血，无附着丧失，无牙槽骨吸收，探诊深度（probing depth，PD）≤3 mm。3 组患者年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。本研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准，所有研究对象知情同意（2016029）。

表1 临床资料（±s）Tab.1 Clinical data（±s）

表1 临床资料（±s）Tab.1 Clinical data（±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs mild group.

Moderate to severe（n=18）12/6 51.50±10.50 6.80±0.531）2）Items Control（n=27）Mild（n=27）Male/Female Age/year PD/mm 17/10 48.04±12.48 1.60±0.35 16/11 53.67±10.59 4.48±0.311）

1.1.2 主要试剂与仪器 Pg标准株（BNCC337441）购 自ATCC 公 司；抗 人CD3、CD4、IL-17A、CD25、CD127 单克隆抗体购自美国Biolegend 公司；蛋白转运抑制剂（BFA）、离子霉素（IO）、佛波酯（PMA）购自美国Biogems 公司；淋巴细胞分离液购自天津华科生物有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒购自南京诺维赞公司；QIAquick PCR 产物纯化试剂盒购自QIAGEN GmbH 公司；厌氧产气袋、密封袋、厌氧指示剂购自日本三菱公司；PCR 仪购自德国TPRO⁃FESSION；FACSCanto TMⅡ流式细胞仪购自美国BD公司；LihgtCycler480Ⅱ荧光定量PCR 仪购自上海罗氏公司。

1.2 方法

1.2.1 牙龈下菌斑样本检测 取健康志愿者上颌第一磨牙颊侧近中位点（健康位点），CP患者则取口内牙周袋最深位，隔湿，无菌刮匙刮去齿龈上菌斑，将灭菌纸尖插入牙周袋直到感觉到阻力后静置30 s，取置于无菌Eppendorf 管，-20 ℃贮存备用。由专科医师检测对照组、牙周炎患者全口牙位的出血指数（bleeding index，BI）、临床附着丧失（attachment loss，AL）及PD。

1.2.2 DNA 提取 样本室温下振荡，12 000 r/min离心，沉淀。按照试剂盒说明提取Pg DNA，微量分光光度计检测DNA 浓度至0.02～20 ng/µl，-20 ℃保存备用。

1.2.3 RT-qPCR Pg引物来自编码16S rRNA的基因，正向序列：5′-GTGCGTAGGTTGTTCGGTAAGTC-3′，反向序列：5′-CTTCGTGCTTCAGTGTCAGTCG-3′，产物为192 bp，引物由上海生工合成。反应条件：总反应体系体积为20 µl：2×SYBR Green Master Mix 10 µl；正、反向引物各1.4 µl；DNA 模板均为1 µl，无菌水补足反应体系。反应程序：预变性95 ℃2 min；变性95 ℃5 s；退火/延伸60 ℃10 s；50 个循环。选择标准菌株Pg BNCC337441 基因组DNA 作为阳性对照，等体积双蒸水作为空白对照。

1.2.4 外周血Th17 细胞、Treg 水平检测 清晨收集各组受试者外周静脉血4 ml，采用Ficoll密度梯度离心法，按照试剂盒说明分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。Th17 检测：转移PBMC 至24 孔板培养，加入PMA 和IO 作用1 h，加入BFA 活化细胞，37 ℃培养4 h，收集细胞，采用抗CD3、CD4 抗体标记，TBS-T 打孔反应后以抗IL-17A 抗体标记，测定Th17 细胞占比。Treg 检测：以抗CD4、CD25、CD127 等抗体标记PBMC，避光反应20 min，PBS 洗涤并重悬，流式细胞仪检测Th17/Treg占比。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，菌量进行对数转换后分析。正态、方差齐资料组间比较采用单因素方差分析，相关分析采用Spearman。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血Th17 细胞、Treg 变化 轻度组与中重度组患者外周血中Th17 细胞比例明显高于对照组（P＜0.05），中重组较轻度组更高（P＜0.05）；轻度组患者外周血Treg 比例明显高于另外两组（P＜0.05），中重度组Treg 比例略低于对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）；中重度组患者外周血Th17/Treg 显著高于其他两组（P＜0.05），轻度组患者外周血与对照组患者外周血相比Th17/Treg较高，但差异无统计学意义（P＞0.05，图1）。

图1 各组Th17细胞、Treg占比及Th17/TregFig.1 Proportions of Th17 cells，Treg and ratio of Th17/Treg in each group

2.2 牙龈下菌斑中Pg 菌量变化 与对照组相比，轻度及中重度组Pg菌量（对数转换后）明显增加（P＜0.05），中重度组较轻度组菌量较高，但差异无统计学意义（P＞0.05，图2）。

图2 各组Pg菌量Fig.2 Amount of Pg bacteria in each group

2.3 Th17细胞、Treg、Th17/Treg与Pg菌量的相关性分析 Pg 菌量值与Th17 细胞百分比、Th17/Treg 呈正相关（r=0.370、0.384，P＜0.05）；Pg 菌量值与Treg呈正相关，但差异无统计学意义（r=0.101，P＞0.05，图3）。

图3 Th17细胞、Treg、Th17/Treg与Pg菌量的相关性分析Fig.3 Correlation analysis of Th17 cells，Treg，Th17/Treg and Pg bacteria quantity

2.4 Th17 细胞、Treg、Th17/Treg、Pg 菌量与PD 的相关性分析 PD 与Pg 菌量值、Th17 细胞百分比、Th17/Treg 呈显著正相关（r=0.622、0.468、0.405，P＜0.001），Treg 与PD 呈正相关，但差异无统计学意义（r=0.028，P＞0.05，图4）。

3 讨论

CP 是口腔科最常见疾病之一。Pg 是牙周优势致病菌的“红色复合体”中的主要成员，通过多种途径入侵口腔上皮细胞、内皮细胞、成骨细胞等多种宿主细胞，与牙周炎进展密切相关［9-10］。探讨口腔局部炎症与免疫细胞激活的相关机制具有一定临床意义。

肿瘤、自身免疫性疾病等患者外周血中均检测出Th17/Treg 两种细胞比例变化或失衡［11］。发挥相互拮抗作用的Th17细胞和Treg 的比值与CP 的相关性逐渐引起关注［12］。本研究显示，CP 组Pg 菌量较对照组明显增加，与牙周PD呈正相关，支持CP患者Pg 感染居于高水平，与既往文献结论一致。牙周组织中普雷沃特氏菌、具核酸杆菌、齿垢密螺旋体和Pg 等增加，一方面与直接破坏牙周组织中上皮屏障、并骨组织渐进性吸收密切相关，另一方面，牙周组织受到牙周致病菌入侵后激活单核吞噬细胞免疫应答，对致病菌抗原进行免疫识别后进一步提呈至区域淋巴结，诱导T 细胞活化、增殖［13-14］。OHLRICH 等［15］研究表明，Th17/Treg 比例失衡导致免疫抑制效应不足，是导致CP患者免疫异常的重要因素之一。

本研究发现，外周血中Th17 细胞占比及Th17/Treg 随PD 增加而升高，提示牙周炎患者外周血中Th17细胞占比提高，Th17/Treg比例失调与牙周炎严重程度相关，原因可能为机体免疫应答异常，促进炎症进展。进一步相关性关系分析，Pg 在牙龈下菌斑中的定植量与患者外周血中Th17 细胞占比、Th17/Treg 呈正相关，且差异有统计学意义，推测牙周致病菌Pg 可促进外周血Th17 细胞生成，并影响Th17/Treg。随着Pg在牙龈部位的局部定植量上升，牙周感染情况加重，通过释放多种细胞因子与炎症因子诱导Th17细胞分化。张莉平等［16］报道，Pg可释放LPS，呈时间依赖性上调PEMC IL-1β、IL-6、IL-23和TGF-β 等Th17 细胞相关细胞因子表达，证实Pg-LPS通过活化单核细胞产生Th17细胞相关炎症因子促进Th17细胞分化。CHENG 等［17］研究发现，Pg可通过激活TLR2/4 受体信号转导途径诱导单核细胞免疫应答，使CD4+T 细胞向Th17 方向分化。葛楠等［18］的动物实验指出，Th17 细胞、Treg 占比及Th17/Treg 在牙周炎患者病情进程不同阶段的变化规律亦不相同，活动期牙周炎大鼠体内外周血Th17细胞与Treg 及Th17/Treg 均显著升高。MOUTSO⁃POULOS等［19］研究报道，Pg可通过激活细胞中NF-κB途径刺激细胞中炎症因子IL-23、IL-6、IL-1β 分泌，使Th17细胞分化成熟。本研究显示，Pg菌量与血清Treg占比并不存在显著相关性。但一项牙周炎模型小鼠实验证实，小鼠口服Pg 后，其外周血FOXP3 表达明显上调，表明Treg 发挥了免疫保护作用［20］。因此，Pg与Th17细胞、Treg是否相关，其具体机制如何仍需进一步研究。

本研究中，轻度牙周炎患者组Treg 比例显著增高，而中重度患者组与健康组差异无统计学意义。牙槽骨吸收是牙周炎发展的重要表现形式之一，免疫细胞与骨代谢CD4+T、Th1、Th1/Th2、Thl7 等增多会增强破骨细胞活性，而CD8+T细胞、Treg等增多则抑制破骨细胞作用［21］。因此推测当牙周炎处于早期阶段时，牙周感染相关病原体激活机体免疫应答，使得CD4+T 细胞分化为Th17 细胞。机体负反馈机制作用下，当牙周炎发展至晚期时，牙周组织内存在由炎症细胞分泌的高浓度IL-6，而IL-6可与TGF-β协同作用，促进CD4+T 细胞分化为Th17 细胞，进而抑制Treg 分化，推断由于大部分CD4+T 细胞分化为Th17 细胞，数量远大于Treg 数量，导致Th17/Treg 升高，促进炎症发展，其原因可能为Treg 减少而导致自身对免疫系统的负调控异常，从而导致自身免疫应答过强，无法得到有效控制。

综上，随着慢性牙周炎发生，Th17 及Treg 数量及两者比值在外周血中异常表达，可能与慢性牙周炎病理进程密切相关，牙龈下菌斑中Pg 可促进Th17/Treg 相关免疫炎症反应，其作用机制有待进一步研究。