HPLC-DAD 波长切换同时测定鸡精中两种合成着色剂

2022-07-25许艳萍

食品安全导刊 2022年12期

唐莉，许艳萍

（镇江市食品药品监督检验中心，江苏镇江 212000）

食物色泽丰富，会增加人的食欲，使人心情愉悦。适量加入符合标准规定的食用着色剂，可以满足各类消费者对色泽的不同要求，从而使得食物的特征风味直观鲜明，让人充满对食物味道的想象，从视觉、嗅觉、味觉上充分吸引顾客。黄色能产生令人振奋的效果，刺激大脑活动情况，让人感受到温暖与舒适，结合鸡精配料表中的鸡肉粉，让人联想到那一碗冒着热气的黄澄澄的鸡汤，因此鸡精生产企业会在鸡精的配料中添加食用色素。食用色素可分为食用天然色素与食用合成色素。部分合成色素可能具有毒性，但由于多数合成色素成本低廉、色泽鲜艳、着色力强以及色调多样，仍被广泛应用。据报道，合成色素有致泻、致癌性，可诱发支气管哮喘、荨麻疹及血管性浮肿等变态反应。为了防止其危害，我国在其使用上都作了严格的限制。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[1]规定，固体调味料中柠檬黄、日落黄限量值均≤0.2 g/kg。

在鸡精中涉及的人工合成色素主要是柠檬黄和日落黄两种，相关现行的国家标准方法主要为《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）[2]，该标准的适用范围为饮料、配制酒、硬糖、蜜饯、淀粉软糖、巧克力豆及着色糖衣制品中合成着色剂的测定，并未包含鸡精调味料。本文在GB 5009.35—2016 的基础上，经参考《水果罐头中中合成着色剂的测定高效液相色谱法》（GB/T 21916—2008）[3]（适用于水果罐头）、《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法》（SN/T 1743—2006）[4]（适用于糖果、饮料）等国家和行业标准，经过大量的实践，结合鸡精调味料的特性，建立了一种同时测定鸡精调味料中柠檬黄、日落黄的高效液相色谱法，取得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪，安捷伦1260 Infinity 带DAD（二极管阵列）检测器；色谱柱，C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）岛津；电子天平，梅特勒，XSE205DU；超声波清洗器，科导；离心机，赛默飞，ST16；Tube Mill control 研磨机，艾卡；涡旋振荡器，海门其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 材料与试剂

市场销售的5 种普通鸡精调味料；甲醇（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司；柠檬黄标准品（CAS：1934-21-0、250 mg/瓶），北京谱析标准技术有限公司；日落黄标准品（CAS：2783-94-0、250 mg/瓶），北京谱析标准技术有限公司；聚酰胺粉（过200 目），上海麦克林生化科技有限公司；柠檬酸（分析纯）、氨水（分析纯）、乙酸（分析纯）、钨酸钠（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、甲酸（分析纯），均为国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 高效液相色谱分析条件

柱温：30 ℃；检测波长：0 ～6 min ，428 nm ；6 ～25 min，484 nm。流动相流速和梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相流速和梯度洗脱程序

1.3.2 样品提取

称取5 g 左右粉碎均匀的鸡精样品于50 mL 离心试管中，加入30 mL 水，涡旋振荡2 min，置于60 ℃水浴中超声20 min，冷却后定容到50 mL，6 000 r/min离心3 min（对于蛋白含量高的样品，在定容前加入1 mL10%钨酸钠溶液沉淀蛋白），取上清液过0.45 μm滤膜过滤，供液相色谱测定[5]。

1.3.3 标准曲线制作

准确称取100 mg 柠檬黄、日落黄标准品用水定容至100 mL，配成1 mg/mL 的标准储备液。逐级稀释标准储备液为1.00 μg/mL、3.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL 和50.00 μg/mL 6 个浓度，按照上述色谱条件进样，以各色素峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作标准曲线。

1.4 结果计算

试样中各着色剂含量按如下公式计算：

式中：X为试样中各着色剂的含量，g/kg；c为从标准曲线上查得进样液中各着色剂的浓度，μg/mL；V为试样稀释总体积，mL；m为试样质量，g；1 000为换算系数。

2 结果与分析

2.1 前处理的选择与优化

市售的5 种鸡精，先按照GB 5009.35—2016 中固体的色素提取方法，发现在聚酰胺吸附过程中呈糊状，抽滤困难，导致试验难以进行。后改进方法用提取出色素的溶液吸附[6]，相对国家标准取得了较好的操作效果。但缺点是前处理耗时较长，步骤多，损耗大，高中低3 种浓度下两种色素回收率在83.2%～91.5%，回收率偏低。

笔者查阅鸡精产品的标准[7]和生产工艺，结合实物配料表，发现鸡精的配料并不复杂，基质对检测目标物的干扰非常小。另外，鸡精颗粒干燥，易溶于水，柠檬黄和日落黄水溶性也较强，根据这些特性，笔者决定采用直接用高纯水在一定温度下超声提取的方法，再通过高速离心机离心，沉淀淀粉等物质得到较纯净的分析溶液。试验证明该提取方法对市售的5 种鸡精都能比较充分地提取出目标物质，色谱峰分离度较好，噪声和干扰较小，对2 种色素都有较好的回收率，且操作快速简便。

2.2 色谱条件的选择

根据现行国家和行业标准，流动相均采用甲醇-乙酸铵溶液（0.02 mol/L）。按照GB 5009.35—2016 设置流动相的梯度洗脱程序，0 ～3 min，甲醇5%～35%；3 ～7 min,甲醇35%～100%；100%继续3 min；回到5%，试验发现由于流动相的变化速率大，带来基线的平稳度减小，而梯度洗脱程序参照GB/T 21916—2008，流动相的变化速率平缓，和GB 5009.35—2016 的梯度程序相比，基线噪声和漂移小，在得到较好的峰型和分离的同时，柠檬黄和日落黄的信噪比提高，检测灵敏度增加。

2.3 检测波长的选择和优化

在400 ～700 nm 用DAD 检测器对标准溶液进行光谱全扫描，柠檬黄、日落黄紫外可见光谱图见图1。

图1 柠檬黄（上图428 nm）、日落黄（下图484 nm）紫外可见光谱图

选择各自最大的吸收波长，柠檬黄波长选择428 nm，日落黄波长选择484 nm。根据此二波长通道的重叠色谱图，如图2、图3 所示，柠檬黄和日落黄在各自的波长内响应值较大(粗线峰为428 nm，细线峰为484 nm)，提高了检测的灵敏度，且出峰处基线较平稳，有利于定性和定量。

图2 标准溶液柠檬黄、日落黄各10 μg/mL 色谱图（二波长重叠）

图3 样品溶液加标柠檬黄、日落黄各10 μg/mL 色谱图（二波长重叠）

根据峰分离情况设置波长切换时间程序，在0 ～6 min 为428 nm，柠檬黄出峰后切换波长为484 nm，得到较好的色谱图和基线，见图4。最终确定使用该波长程序方法进行标准溶液和样品的分析。

图4 波长切换程序下样品溶液加标柠檬黄、日落黄各10 μg/mL 色谱图

2.4 标准曲线和检出限

根据1.3.3 中的6 个标准溶液绘制标准曲线。以S/N=3，即以3 倍信噪比计算检测限，以S/N=10，即以10 倍信噪比计算定量限。线性范围、回归方程、检测限、定量限见表2。由表2 可知，柠檬黄和日落黄在1 ～50 μg/mL 的浓度下，相关系数（R2）分别为0.999 89 和0.999 99，线性关系良好，检出限均为0.15 mg/kg，小于国家标准GB 5009.35—2016 和GB/T 21916—2008 的检出限，满足检测需求。