基于基质辅助激光解吸电离飞行时间技术的两种质谱检测系统对于临床常见菌株鉴定能力的研究

张宇琼，陆文香，袁 垆，陈海鹏，张国栋

1.苏州市立医院检验科，江苏 苏州 215000；2.南京医科大学附属苏州医院检验科，江苏 苏州 215000

2008年MALDI-TOF MS系统首次被临床微生物实验室广泛用于细菌鉴定［1-3］。近来有研究表明，该技术不仅能快速鉴定常见细菌，对于通常难以识别的物种，例如酵母菌，厌氧菌和苛养菌也能鉴定出来［4-5］。目前，两大质谱鉴定系统，Bruker microflex和Vitek MS已在全球临床微生物实验室中广泛使用，用于常见细菌和酵母菌株的常规鉴定。随着MALDI-TOF MS系统在国内外临床微生物鉴定中广泛应用，临床用户对仪器的需求越来越迫切，但由于进口仪器价格及其维护成本较高，使得许多基层医院望而却步。本研究旨在比较并评估安图Autof ms1000和布鲁克Microflex LT两个系统在临床常见微生物鉴定的准确性和临床实用性方面的表现，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 标准株 35株标准菌株和室内质控/室间质评菌株（涵盖革兰氏阴性杆菌、阳性球菌、阳性杆菌以及需氧和厌氧菌），均已经16/18SrDNA或ITS测序鉴定，共22个菌属、34个不同的菌种。

1.1.2 临床株 收集苏州市立医院2018年11月—2019年2月临床样本分离的菌株共3 312株。样本类型包括尿液、痰液、脑脊液、胸腹水、创口分泌物、阴道分泌物及血液等。

1.1.3 仪器与试剂 试剂：羟基肉桂酸（CHCA）、标准品IVD Bacterial Test Standard（德国Bruker公司）。乙腈、三氟乙酸、甲酸和无水乙醇（美国Sigma公司）。血平板、麦康凯平板、巧克力平板及沙保弱平板（中国安图生物公司）。厌氧产气包（法国生物梅里埃公司）。仪器：Microflex LT（德国Bruker公司）。Autof ms1000（中国安图生物公司）。二氧化碳恒温孵育箱（美国Thermofisher公司）。超速离心机（安徽中科中佳仪器有限公司）。

1.2 方法

（1）质谱参数设置。MALDI-TOF MS鉴定使用前采用标准品BTS进行校正。安图MALDI-TOF MS分析：MALDI-TOF MS系统以线性正性模式，采集相对分子质量2～20 kD的图谱，结合预安装在仪器中的分析软件对图谱进行分析。布鲁克MALDI-TOF MS分析：MALDI-TOF MS系统同样以线性正性模式，采集相对分子质量2～20 kD的图谱，结合Biotyper 3.0软件进行分析。（2）质谱上机操作。分别依据制造商说明书和“中国临床微生物质谱应用专家共识”［6］进行质谱操作。常规细菌，挑取平板上培养的单个菌落均匀涂抹在靶板上，滴加1 L基质液，室温干燥后进行上机检测。若怀疑为念珠菌，则先滴加1 L的70%甲酸溶液，彻底干燥后再滴加1 L基质液，室温干燥后进行上机检测。若有丝状真菌需要鉴定，则利用甲酸乙腈提取法预处理细菌，取1 L提取液点至靶上，彻底干燥后再滴加1 L基质液，室温干燥后进行上机检测。（3）分值说明。①安图数据库内现有菌株达9 050株，超过370个属，共计2 613种。鉴定分数为10分制，分值≥9.5分为种水平置信，可能的亚种。分值在9.0～9.5分为种水平置信。分值6.0～9.0分为属水平置信。分值＜6.0分为不可信。②布鲁克主库内现有菌株数5 989株，2 371种。鉴定分数为3分制，评分≥2.3分为种水平高度可信。分值2.0～2.3分为属水平可信，种水平参考。分值1.7～2.0分为属水平参考。分值＜1.7分为不可信。（4）结果判定。“正确鉴定到种”即质谱鉴定结果与参考方法在种水平上一致。“正确鉴定属”即质谱鉴定结果与参考方法在属水平上一致。“不可信的鉴定”为质谱鉴定分值均＜6.0分或＜1.7分。“误鉴定”为质谱鉴定分值为种水平可信，但结果与实际菌株名称不一致。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准株鉴定结果

标准株经检测发现，其中WSB1512鼠伤寒沙门菌和WSB1703牛沙门氏菌鉴定为Salmonella sp，WSB1507星型诺卡氏菌鉴定为Nocardia sp，WSB1610牛链球菌鉴定为Streptococcus gallolyticus，经查阅文献［7］及专家共识，这是由于MALDI-TOF MS方法本身的局限性导致无法区分。以上均视为准确鉴定。而WSB1611宋内志贺氏菌两个系统均鉴定为大肠埃希氏菌，虽然是由于方法学局限导致，但还应算误鉴定。而Microflex LT误将WSB非O1，O139霍乱弧菌Vibrio cholerae误鉴定为Vibrio albensis。以上结果修正后，结果提示Autof ms1000和Microflex LT二个质谱仪鉴定结果存在一致性，但是一致性较差，差异有统计学意义（Kappa=0.36，P=0.017）。Autof ms1000和Microflex LT种水平鉴定准确性分别为85.7%和71.4%，差异有统计学意义（P=0.044），见表1。

表1 标准株MALDI-TOF MS鉴定结果 株

2.2 临床菌株总的鉴定结果

对于3 312株临床菌株来说，Autof ms1000和Microflex LT二者的鉴定情况存在一致性，但一致性一般，差异有统计学意义（Kappa=0.452，P＜0.001）。Autof ms1000种水平鉴定准确性为85.0%，明显高于Microflex LT（69.9%）；二者属水平鉴定准确性分别为96.4%和94.3%；不可信菌株数分别为115株（3.5%）和182株（5.5%）。对于除酵母菌和丝状真菌外的2 727株临床细菌来说，二者属水平鉴定准确性分别为95.7%和96.6%，种水平鉴定准确性分别为85.7%和79.1%。

2.3 临床常见细菌鉴定结果

1 369株常见革兰氏阴性菌（肠杆菌科细菌和非发酵菌）中，有9株沙门氏菌只鉴定到沙门氏菌属，是因为受MALDI-TOF系统限制，目前只能鉴定到属水平［8］。Autof ms1000和Microflex LT种水平鉴定准确性分别为83.4%和81.2%。920株常见革兰氏阳性球菌（葡萄球菌，肠球菌和链球菌）中，Autof ms1000和Microflex LT种水平鉴定准确性分别为93.6%和80.2%，见表2。

表2 3 312株临床菌株MALDI-TOFMS鉴定结果 株

2.4 真菌的鉴定结果

570株念珠菌中，Autof ms1 000和Microflex LT属水平鉴定准确性分别为99.6%和84.9%，种水平鉴定的准确性分别为81.6%和27.2%。不可靠的鉴定比例分别为0.3%和15.1%。在15株其他真菌中，Autof ms1 000和Microflex LT属水平鉴定准确性分别为100.0%和40.0%。种水平鉴定准确性分别为86.7%和6.7%，见表3。

表3 570株念珠菌的鉴定结果 株

2.5 临床不常见细菌鉴定结果

在170株（兼性）厌氧菌中，Autof ms1 000和Microflex LT种水平鉴定准确性分别为74.1%和68.8%。其他160株菌，二者种水平鉴定准确性分别为65.6%和64.4%，见表4。

表4 其他真菌的鉴定结果 株

2.6 误鉴定细菌结果

Autof ms1000和Microflex LT鉴定不一致的结果共有7株，根据16SrDNA测序结果发现，二者鉴定错误的比率分别为71.4%和85.7%。

3 讨论

本研究首次对安图Autof ms1000系统与Microflex LT系统在临床微生物实验室中关于常见细菌和真菌鉴定能力进行了比较。研究结果表明，总体上，Autof ms1000和Microflex LT两种质谱检测系统对临床常见细菌属水平鉴定的准确性均超过94%，与前人研究结果相似。同时当临床样本扩大后，二者对于菌株鉴定结果的一致性由较差升为一般，即二者对于菌株的鉴定结果基本一致。而Autof ms1000种水平鉴定的准确性明显高于Microflex LT却都略低于前人的研究［1,9,10］。而除念珠菌和丝状真菌外的2 727株一般细菌中，二者种水平鉴定准确性差异无统计学意义。研究者进一步分析发现，是由于其中某些种属的菌株所占比例较大而其MS分值较低，从而可能会导致总的种水平鉴定准确性较低。深入分析发现，酵母菌和丝状真菌是Microflex LT系统产生不可靠鉴定结果的主要菌株。本研究发现，在570株念珠菌中，Microflex LT种水平鉴定准确性仅为27.2%（MS评分≥2分），与Hyun等［11］研究结果一致，而Autof ms1000为81.6%。当选取MS评分≥1.7分时，Microflex LT鉴定准确性提高到84.9%，这与Pence等［3］研究结果一致，即对于临床常规念珠菌的鉴定最优选取1.7分作为临界值，而此时Autof ms1000高达99.7%，同时证实甲酸直接涂布法在临床简便可行。本次研究中，真菌在所有菌株中所占比例达17.2%，且主要来自生殖道分泌物和痰标本，其快速准确的鉴定对于改善临床患者预后极为重要，而安图Autof ms1000在真菌鉴定上更具优势。可能是由于其是最新研发上市且拥有具有知识产权的中国本土化的真菌数据库以及一些少见的特色菌株。尤其是丝状真菌，因其包含有不同生长时间段的真菌谱图而更丰富、全面，而布鲁克质谱检测系统上市较早，本实验室

数据库未及时更新以及特定峰值数量较少而导致无法准确鉴定。Dupont等［12］研究表明，102株丝状真菌中，布鲁克Microflex LT种水平鉴定准确性为16.7%，属水平鉴定准确性为42.2%。本次研究中，Autof ms1000和Microflex LT对于其他15株真菌种水平鉴定准确性分别为86.7%和6.7%，属水平鉴定准确性分别为100.0%和40.0%。与前人研究结果一致。不常见细菌中，对于厌氧菌种水平鉴定的准确性二者有可比性。

关于7株鉴定结果不一致的菌株，Autof ms1000和Microflex LT鉴定错误的菌株数分别为5株和6株。Kivanc等［9］研究结果中，Vitek-MS系统和布鲁克Microflex LT的误鉴定率分别为0.4%和0.3%，本研究结果与其一致。对不一致菌株进行16s rDNA测序后发现，鉴定错误的几个菌株，均为同一菌属的不同菌种。MALDI-TOF MS系统鉴定微生物是基于系统数据库中已记录存在蛋白质波峰谱图，而这些谱图的形成主要基于核糖体蛋白质，因此MALDI-TOF系统对于相近菌种间的区分具有内在局限性，如沙门氏菌属，肠杆菌科细菌及枸橼酸杆菌属间的区分。这些密切相关的菌种区分对临床影响不大，一般来说，临床上很少有因为MALDI-TOF MS系统数据库的局限而需要进行分子测序鉴定的菌株。本次研究的局限性在于不常见菌的鉴定较少，包括丝状真菌，厌氧菌和分枝杆菌等的鉴定。MALDI-TOF MS识别酵母菌和丝状真菌的能力已被多次证明。对于MALDI-TOF MS用于分枝杆菌的鉴定能力，还需要进一步的研究来确定，但Saleeb等［13］最近的研究已经取得了显著成效。

综上所述，两个质谱系统都可以胜任临床常见细菌的鉴定工作。Autof ms1000在念珠菌的鉴定方面，具有一定的优势。尤其在新型冠状病毒肺炎疫情期间，快速而准确的细菌鉴定，不仅可以减少工作人员暴露时间，避免造成医务人员自身感染，还能及时将药敏结果及时反馈与临床，对于合并细菌感染的重症患者的用药具有指导意义。但本研究样本量不足，实验环境及不同人员的操作差异也可能会对结果产生一定的影响，后续仍需扩大临床样本量进行近一步分析。同时二者数据库仍需不断完善和扩充，后续能对疑难菌及少见菌的鉴定提供建设性建议，有效缩短菌株鉴定时间，为临床用药及诊疗提供准确可靠的鉴定依据。