河南省新乡市禽腺病毒的分离鉴定

王俊娜，李凌薇，王秋霞，师 雯，张 新，刘兴友，姜金庆，裴大伟

（1. 河南科技学院 动物科技学院，河南 新乡 453003；2. 新乡学院 生命科学技术学院，河南 新乡 453003；3. 厚德食品股份有限公司，吉林 辽源 136200 ）

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAdV）为无囊膜的双链DNA病毒，为腺病毒科、腺病毒属的成员，是家禽和野禽常见的病原之一。FAdV 包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3 个群，其中Ⅱ群FAdV 主要引起火鸡出血性肠炎；Ⅲ群FAdV 主要引起减蛋综合征[1]；而临床上常见的心包积水（Hydropericardium syndrome，HPS）、包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）和心包积水-肝 炎 综 合 征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）多为Ⅰ群引起[2]。HHS 最早于1987 年发生在巴基斯坦安哥拉地区，随后逐渐传入多个国家，成为严重危害家禽业的传染病之一。2012 年起，我国山东、河北、辽宁等地陆续出现HHS 病例。2015 年夏季，Ⅰ群FAdV 在山东、河南等多个省份肆虐[3]，给家禽业造成了重大的经济损失。目前，Ⅰ群中FAdV-4 可以单独引起发病，而其他毒株往往需要免疫抑制因素的协同作用才能致病[4]。

FAdV 外壳蛋白主要由240 个六邻体蛋白（Hexon）、12 个五邻体蛋白（Penton）和纤维蛋白（Fiber）等构成，其中Hexon 蛋白是主要的结构蛋白，也是病毒表面含量最高的蛋白质，带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇，可用于FAdV 基因分型[5-6]。2020 年6—8 月，河南省新乡市周边地区多个养鸡场发生疑似FAdV 感染类疫病，感染鸡多为4～6 周龄的雏鸡。为了解新乡市周边养殖场FAdV流行情况，采集4个规模化养殖场送检的疑似FAdV感染的15份鸡肝脏病料，针对FAdV-4Hexon基因保守区设计引物，进行PCR 检测，对获得的扩增产物进行测序和序列分析，以期了解FAdV 新乡株的遗传进化关系，为研究其分子流行病学奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料样品 对4个养鸡场送检的病鸡进行剖检，随机采集15 份疑似FAdV 感染鸡肝脏病料。

1.1.2 试验动物 SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，SPF鸡由SPF鸡胚孵化。

1.1.3 主要试剂 rTaq DNA 聚合酶、DL2000 Marker、pMD18-T 载体、病毒DNA 提取试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Omega 公司；其他常规试剂均为分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参考GenBank 中FAdV-4 SDSX

株基因序列（GenBank 登录号为KT899325），利用Oligo（Version 6.0）软件，针对Hexon基因设计2对特异性引物，引物序列和扩增长度见表1。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 试验中所用PCR扩增引物Tab.1 Primers used for PCR in this study

1.2.2 组织病料DNA 的提取 取采集的病鸡肝组织，研磨后加入含青链霉素的PBS 制成悬液，反复冻融3 次，8 000 r/min 离心10 min，取上清液使用试剂盒按说明书提取病毒DNA。

1.2.3Hexon基因的PCR 检测 以提取的DNA 为模板，先使用设计的第1对引物进行扩增，再使用第2 对引物进行检测。PCR 反应体系：模板DNA 2 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq 聚合酶0.5 μL，补水至25 μL；以去离子水为空白对照。扩增程序：95 ℃2 min；95 ℃1 min，55 ℃30 s，72 ℃20 s，30 个循环；72 ℃10 min；4 ℃终止。PCR产物经1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.2.4 扩增产物测序及序列分析 扩增产物回收后送生工生物工程（上海）有限公司进行测序鉴定，并对所得序列进行分析。与GenBank 中FAdV-4Hexon基因核苷酸序列进行比对分析，并构建系统进化树。参考病毒株包括印度、韩国和国内的一些分离株，具体信息见表2。

表2 同源性分析所参考毒株信息Tab.2 Strain information referenced for homology analysis

续表2 同源性分析所参考序列信息Tab.2（Continued） Sequence information referenced for homology analysis

1.2.5 动物回归试验 根据测序结果，选取鉴定为阳性的病鸡肝脏组织，液氮研磨后，加入无菌PBS充分混匀溶解，10 000 r/min 离心10 min，收集上清液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后，经卵黄囊接种9日龄SPF鸡胚；收集48 h后死亡和未死亡鸡胚尿囊液，盲传7 代进行纯繁；收集尿囊液，过滤除菌，按0.2 mL/只的剂量（含103EID50病毒）接种3 周龄SPF鸡（对照组接种同体积的无菌PBS），每日观察临床症状。对病死鸡剖检，观察病理变化，并取肝脏组织制备石蜡切片，HE染色观察。

2 结果与分析

2.1 Hexon基因片段PCR扩增结果

将采集的15份病死鸡肝脏组织研磨，提取病毒DNA 作为模板，使用设计的Hexon-F1/R1 引物对进行扩增，并使用Hexon-F2/R2 引物对进一步验证。Hexon-F1/R1 引物对电泳结果显示，有8 个样品在约300 bp 处出现明显特异性条带，有4 个样品出现弱条带，与预期扩增片段长度相符；另有3个样品未出现明显条带（图1）。进一步使用Hexon-F2/R2 引物对进行验证扩增，结果与Hexon-F1/R1 引物对扩增结果一致，表明设计的引物能够特异性扩增Hexon基因片段。

图1 不同样品Hexon基因片段的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of Hexon gene fragment in different samples

2.2 Hexon基因扩增片段序列比对结果

将扩增产物进行切胶纯化，回收产物送公司进行测序。测序结果经NCBI BLAST 分析显示，扩增的部分Hexon基因序列均与FAdV-4 GDMZ 株（MG856954） 、 FAV-C CH/GDHZ-S7/2017 株（MK875249）、FAV-C GX-1 株（MH454598）等序列高度同源。测序结果进一步证实，本研究设计的引物具有较高的特异性，扩增得到特异性的部分Hexon基因片段。

2.3 Hexon基因片段序列分析结果

根据BLAST 比对结果，扩增的基因片段为FAdVHexon基因2 个不同位置的序列，将毒株命名为XX。将XX 与GenBank 参考毒株的Hexon基因核苷酸序列进行同源性分析（图2），结果显示，XX 与FAdV-4Hexon高度同源，相似性大于95%；而与FAV-1 代 表 株CELO（U46933）同 源 性 较 低，为71.3%；与鸭FAdV-Ⅰ型代表株EDS（Y09598）同源性为15.9%。

图2 FAdV核苷酸序列同源性比对结果Fig.2 Homology alignment results of nucleotide sequences of FAdV Hexon gene

根据同源性分析结果，利用Mega软件构建系统进化树（图3）。从图3 可以看出，本研究分离的XX株与FAdV-4 毒株处于同一个分支，有较近的亲缘关系，而与FAdV-1 代表株CELO 和鸭FAdV-Ⅰ型代表株EDS 位于不同的分支，亲缘关系较远，进一步表明分离的毒株为FAdV-4型毒株。

图3 FAdV-4型XX株的遗传进化分析Fig.3 Phygenetic analysis of FAdV-4 XX strain

2.4 动物回归试验结果

将纯繁后的病毒感染3 周龄SPF 鸡，感染后前2 d，SPF 鸡无明显临床症状，仅略有精神沉郁现象；3 d 后病鸡出现明显的精神沉郁、食欲减退现象，部分鸡出现腹泻情况；4 d后有鸡只开始死亡，7 d后死亡逐渐停止；观察至10 d，病鸡死亡率达60%。剖检可见死亡鸡出现与临床采集病例相似的症状，肝脏质脆易碎，表面出现大小不等的出血点；心脏有明显的心包积液，呈淡黄色透明状（图4）。

图4 FADV-4 XX株感染鸡组织病变Fig.4 Tissue lesions of SPF chicken infected by FADV-4 XX strain

将采集的肝脏进行组织病理学分析，与对照组鸡的肝脏切片比较，结果显示，感染组病鸡的肝脏细胞核固缩，胞质溶解，有淋巴细胞浸润，出现明显的坏死灶，在坏死灶的中心可看到包涵体（图5）。

图5 FADV-4 XX株感染鸡组织病理学观察Fig.5 Histopathologic observation of SPF chicken infected by FADV-4 XX strain

3 结论与讨论

2012 年以来，禽心包积水-包涵体肝炎综合征在我国时有发生；2015 年在我国多个地方暴发流行，给我国养禽业造成了重大的经济损失[3]。该病主要由FAdV-4引起，具有高度传染性，导致高死亡率[7]，世界各地均有发生[8-10]。目前，禽心包积水-包涵体肝炎综合征在我国仍然零星散发，新乡市周边多个鸡场出现疑似病例，死亡率较之前有所下降。

新乡市畜牧业比较发达，据新乡市统计局统计，2018 年底，全市生猪存栏272.90 万头，家禽存栏3 159.16 万只[11]，一旦发生病毒性疾病，将会给养殖业带来巨大的经济损失。为了解目前FAdV-4在新乡市的流行情况，本研究参照GenBank 中FAdV-4Hexon基因序列，设计2 对引物，对新乡市周边4 个养鸡场采集的16份疑似FAdV感染的肝脏组织样品进行检测，检出12份阳性样品，样品阳性率占75%，确定该病依然存在，对该病的防控仍需重视。

从测序结果来看，本研究扩增得到的几个序列片段完全一致，判断为同一个毒株，命名为XX 株。XX 株与FAdV-4 型参考毒株高度同源。测序结果表明，新乡市流行的FAdV 主要为FAdV-4，同时也说明Hexon基因比较保守，能够用于FAdV毒株的进化分析[12-16]。由于本研究仅扩增了Hexon基因的部分片段，其余部分是否存在变异或缺失，还需要进一步扩增Hexon基因的全长序列确定。

本研究分离的FAdV-4 XX 株能够引起SPF 鸡精神沉郁、食欲减退、闭眼嗜睡甚至死亡等临床症状，剖检可见典型的心包积液，病鸡肝脏肿大、质脆、有明显的坏死灶，这些症状和病理变化与其他人分离毒株感染动物的结果一致[17-18]。本研究中，感染鸡只死亡率可达60%，表明分离毒株毒力较强。根据动物回归试验结果，结合测序和序列分析结果，进一步证实分离的病毒为FAdV-4。本研究依据Hexon基因序列对分离的毒株进行分型，与以往FAdV 分离鉴定的依据一致[19-23]。这些结果为进一步研究禽腺病毒分子流行情况和防控提供了技术支持。