黄皮等23 种植物提取物的抑菌活性研究

廖金梅，邓业成，邓志勇，蒙思妤，韦坚芬，黄玲玉，徐紫薇，骆海玉

（珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室/广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541006）

我国植物资源丰富多样，是结构多样、活性特殊的天然活性物质的重要来源，其中相当多的植物成分具有抑菌活性[1-3]。发掘具有较好农用抑菌活性的植物，可为植物源抑菌剂的开发提供材料[4-8]。我国农业主要危害为病、虫和草害，其中由真菌及细菌引起的病害所带来的作物损失极大[9-10]。为了防治真菌性病害和细菌性病害，大量地使用化学农药进行防治[11]，导致土壤及水源中的农药残留问题日益严重[12-15]。植物源抑菌剂具有环保、无残留、无污染、对人畜安全无毒、对病害特异性强等特点，采用植物源抑菌剂替代化学抑菌剂防治植物病害，有助于促进农业良好、绿色发展[16-18]。因此，对植物进行抑菌活性筛选，深入研究植物天然有效成分对病原菌的防治作用对植物源抑菌剂的开发具有重要意义。

目前，有关植物活性成分对病原菌的抑制活性研究主要为单一地对某种或某几种动物病原细菌，以及单一地对某种或某几种植物病原真菌。如王红刚等[19]研究了九里香等5 种南药植物提取物对番茄晚疫病菌致病疫霉的抑制作用，发现九里香提取物的石油醚萃取组分对致病疫霉的抑菌活性较高。张梅等[20]通过测定9 种植物提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌3 种病原细菌的抑菌强度，从中筛选了4种植物提取物进一步复配，得到一种抑菌性较强的植物源防腐剂。吴文能等[21]研究发现，花椒、金银花、生姜和八角茴香4 种植物提取物对猕猴桃软腐病4种主要致病菌均具有一定的抑菌活性。

自然界中现有植物约50万种，但仅5%～15%的植物被研究过，可见作为抑菌药物来源的植物资源和天然产物的潜力尚未充分利用[22-23]，且同时以多种植物病原真菌和多种动物病原细菌作为供试菌，研究广谱抑菌植物的报道较少。鉴于此，测定了黄皮等23 种植物的甲醇提取物对8 种植物病原真菌和9 种动物病原细菌的抑菌活性，旨在寻找对植物病原真菌与动物病原细菌有广谱抑菌活性的植物，为下一步分离及纯化植物的活性成分提供研究材料，并为开发更丰富的植物源抑菌剂提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供 试 植 物：杨 梅[Myrica rubra（Lour.）S. et Zucc.]、黄皮[Clausena lansium（Lour.）Skeels.]、构树（Broussonetia papyrifera）等23 种供试植物原材料采自广西桂林、广西梧州。

供试8 种植物病原真菌：辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、茶轮斑病菌（Pestalotiopsis theae）、甘蓝黑斑病菌（Alternaria oleracea）、甘蔗凤梨病菌（Ceratocystis paradoxa）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、贡柑链格孢菌（Alternaria citri）、根腐病菌（Fusarium oxysporum）、白绢病菌（Athelia rolfsii）。

供试9 种动物病原细菌：藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、普通变形杆菌（Proteusbacillus vulgaris）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、炭疽杆菌（Bacillus anthraci）、溶 壁 微 球 菌（Micrococcus lysodeikticus）、乙 型 副 伤 寒 杆 菌（Bacterium paratyphosumB）。

以上供试植物病原真菌及动物病原细菌均由广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室化学生态实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 供试植物甲醇提取物的制备 参照王学贵等[14]和魏敬怀等[15]的方法，通过甲醇冷浸提取法对供试植物的有效成分进行初步提取。采集新鲜的植物叶片、枝、花或茎等部位，烘干粉碎后用筛网（孔径0.3 mm）过筛，取植物干粉、甲醇按1∶5（m/V）的比例混匀，超声振荡30 min 后，于室温下浸泡72 h 进行抽滤，滤液经旋转蒸发仪减压浓缩得到样品植物的甲醇提取物。滤渣重复浸泡2 次并旋蒸，合并3 次旋蒸所得的甲醇提取物，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 植物有效成分的分离（液-液萃取分离） 根据初筛结果进行第2 次筛选，采用液-液萃取分离法[24-26]对黄皮叶甲醇提取物进行初步分离。取黄皮叶甲醇提取物，用适量蒸馏水溶解或分散后，依次用与蒸馏水等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、萃余物，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 对8种植物病原真菌的抑制活性测定 结合带毒平板法和菌丝生长速率法[27-29]，测定23 种植物甲醇提取物（10 mg/mL）以及黄皮4 种萃取物（5 mg/mL）对8 种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性。将植物提取物或萃取物配制成相应浓度的药液（溶剂为丙酮∶无菌水=1∶1），取1 mL药液（对照用等量溶剂代替）与9 mL PDA 培养基混合均匀，倒入直径为9 cm 的培养皿中待其冷却。用直径为0.4 cm 的无菌打孔器切取菌饼，每皿接3 个菌饼（呈“品”字形分布），菌饼长满菌丝面朝下紧贴在培养基表面，每个处理设3 个重复。置于培养箱中（27±1）℃倒置培养72 h 后，采用十字交叉法测量菌落生长直径，取平均值，计算抑菌率。

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）÷（对照菌落直径-0.4）×100%。

1.2.4 对8种植物病原真菌毒力大小的测定 按照

1.2.3 所述方法将植物提取物或萃取物依次配制一系列浓度梯度的带毒平板，每个浓度处理设3 个重复，根据抑菌率测定植物提取物或黄皮4 种萃取物对病原真菌的毒力大小，并求出毒力回归方程、有效抑制中质量浓度（EC50）等。

1.2.5 对9种动物病原细菌的抑菌活性测定 结合带毒平板法和平板稀释涂布法[30]，测定23 种植物甲醇提取物（10 mg/mL）以及黄皮4 种萃取物（5 mg/mL）对9 种动物病原细菌的抑制活性。将适量植物提取物或萃取物配制成一定浓度的药液（溶剂为丙酮∶无菌水=1∶1），取1 mL 药液（对照用等量溶剂代替）与9 mL PDA 培养基混合均匀，倒入直径为9 cm 的培养皿中待其冷却。取已活化菌种0.1 mL 与无菌水9.9 mL 混匀制成菌悬液，吸取菌悬液0.1 mL 到平板培养基上，涂布均匀制成带毒培养平板，每个处理设3 个重复。阳性对照用溶剂代替药液，阴性对照涂布无菌水，其他条件不变，于（37±1）℃培养72 h后，观察结果并记录。

1.2.6 对9 种动物病原细菌最低抑制质量浓度（MIC）的测定 采用倍数稀释法，将植物提取物或黄皮4 种萃取物用溶剂（丙酮∶无菌水=1∶1）溶解配成药液，按照1.2.5中所述方法依次配制一系列浓度梯度的带毒培养平板，（37±1）℃培养72 h 后观察结果，以不长菌的最低浓度为药液对病原细菌的MIC值。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 25.0 软件对数据进行统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 23种植物甲醇提取物对8种植物病原真菌的抑菌活性

从表1 可以看出，当植物甲醇提取物质量浓度为10 mg/mL 时，黄皮叶甲醇提取物对所有供试植物病原真菌都有一定的抑菌作用，且抑菌率均在60%以上，其中对玉米大斑病菌、茶轮斑病菌、甘蔗凤梨病菌的抑制效果较佳，抑菌率分别为85.64%、82.94%、82.49%；对白绢病菌、辣椒炭疽病菌的抑菌率分别为76.89%、68.09%；而对甘蓝黑斑病菌、贡柑链格孢菌、根腐病菌的抑菌率分别为64.81%、63.55%、61.19%。

表1 23种植物甲醇提取物（10 mg/mL）对8种植物病原真菌的抑制活性Tab.1 Inhibitory activity of methanol extracts（10 mg/mL）from 23 plants against eight plant pathogenic fungi

商陆对辣椒炭疽病菌、茶轮斑病菌、甘蔗凤梨病菌、玉米大斑病菌、白绢病菌5种植物病原真菌也具有较好的抑菌作用，尤其是玉米大斑病菌，抑菌率达91.70%；杨梅、五爪金龙、苏门白酒草和假臭草等植物甲醇提取物集中表现在对玉米大斑病菌、甘蓝黑斑病菌或甘蔗凤梨病菌等的抑菌作用上，尤其是假臭草，对甘蔗凤梨病菌的抑菌率高达94.55%。

此外，构树、黄花稔2种植提取提物对茶轮斑病菌，苏门白酒草、酸模2种植物提取物对贡柑链格孢菌以及决明提取物对根腐病菌分别表现出不同程度的负抑制效果，表明以上植物的提取物中可能存在对茶轮斑病菌、贡柑链格孢菌或根腐病菌菌丝生长起促进作用的物质。

上述结果表明，黄皮、杨梅、五爪金龙、苏门白酒草、假臭草、商陆6种植物的甲醇提取物对植物病原真菌具有较好的抑制作用，其中黄皮叶甲醇提取物对植物病原真菌的抑制活性较为明显和广谱。

2.2 黄皮等6种植物甲醇提取物对植物病原真菌的毒力

为进一步明确黄皮、杨梅等6种植物甲醇提取物对植物病原真菌的抑制活性，测定了6种植物甲醇提取物对相应植物病原真菌（质量浓度为10 mg/mL时，抑菌率≥60%）的毒力。结果（表2）表明，黄皮叶甲醇提取物对玉米大斑病菌菌丝的毒力最高，EC50值为0.033 2 mg/mL，对甘蔗凤梨病菌、白绢病菌的EC50值分别为0.406 4、0.750 1 mg/mL；黄皮叶甲醇提取物对根腐病菌菌丝的毒力最低，EC50值为5.172 7 mg/mL，对辣椒炭疽病菌、茶轮斑病菌、甘蓝黑斑病菌和贡柑链格孢菌的EC50值则为1.325 3～4.188 3 mg/mL。

表2 6种植物甲醇提取物对植物病原真菌菌丝的毒力Tab.2 Virulence of methanol extracts from six plants against hyphae of plant pathogenic fungi

杨梅、五爪金龙、苏门白酒草、假臭草及商陆等几种植物中，以五爪金龙甲醇提取物对玉米大斑病菌菌丝毒力最高，EC50值为0.080 3 mg/mL；同时，五爪金龙、苏门白酒草、假臭草及商陆的甲醇提取物对甘蔗凤梨病菌菌丝的毒力均较高，EC50值为0.255 9～0.789 7 mg/mL。

2.3 23种植物甲醇提取物对9种动物病原细菌的抑菌活性

由表3 可见，当甲醇提取物质量浓度为10 mg/mL 时有15 种植物的甲醇提取物对至少1 种动物病原细菌具有抑菌活性，其中黄皮叶与杨梅叶的甲醇提取物对9 种动物病原细菌均有抑制作用，且最低抑制质量浓度均≤10 mg/mL。

表3 15种植物甲醇提取物对9种动物病原细菌的MICTab.3 MIC of methanol extracts from 15 plants against nine animal pathogenic bacteria

蟛蜞菊除对炭疽杆菌、假臭草除对普通变形杆菌无抑制作用或弱抑制作用外，二者的甲醇提取物对其余相应的8种动物病原细菌均有较好的抑制作用，且只有这2种植物和黄皮、杨梅的甲醇提取物对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。苏门白酒草对藤黄微球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、炭疽杆菌均有较好的抑制作用。

综上可知，黄皮、杨梅、蟛蜞菊、假臭草、苏门白酒草、五爪金龙等15 种植物甲醇提取物对至少1 种动物病原细菌的生长具有抑制活性，其中黄皮叶与杨梅叶的甲醇提取物对动物病原细菌的抑制活性较为明显和广谱。

2.4 15种植物甲醇提取物对相应动物病原细菌的MIC

由表3 可知，黄皮叶甲醇提取物对9 种动物病原细菌的抑制活性优于其他植物提取物的活性，MIC 为0.625～2.5 mg/mL。其次，蟛蜞菊提取物对大肠杆菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC 处于1.25～5 mg/mL，对其余5 种动物病原细菌的MIC均为0.625 mg/mL。杨梅叶提取物对藤黄微球菌的MIC为1.25 mg/mL，对其余8种动物病原细菌的MIC则≥2.5 mg/mL。除苏门白酒草提取物对大肠杆菌、筒轴茅提取物对藤黄微球菌的MIC 为2.5 mg/mL外，枇杷、五爪金龙、艾草、假臭草、三叶鬼针草、野葛等多种植物提取物对相应动物病原细菌的MIC均≥5 mg/mL。

2.5 黄皮叶提取物各萃取物的抑菌活性

2.5.1 对植物病原真菌的抑制活性 初筛中测定了23种植物提取物对8种植物病原真菌及9种动物病原细菌的抑菌活性，结果表明，黄皮叶甲醇提取物的综合抑菌活性较好。根据初筛结果进行第二次筛选，采用液-液萃取分离法对黄皮叶甲醇提取物进行初步分离，得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物，各部分的百分含量分别为36.67%、9.03%、23.57%和21.65%。分别测定各萃取物（5 mg/mL）对8 种植物病原真菌的抑菌活性，结果见表4。

表4 黄皮叶提取物各萃取物（5 mg/mL）对8种植物病原真菌的抑制活性Tab.4 Inhibitory activities of different extracts（5 mg/mL）from crude extracts of Clausena lansium leaves on eight plant pathogenic fungi

石油醚萃取物对根腐病菌的抑菌率为65.14%，对其余植物病原真菌的抑菌率均高于75%，石油醚萃取物对除玉米大斑病菌外7种植物病原真菌的抑菌率均显著高于另外3种萃取物的抑菌率。

乙酸乙酯萃取物对甘蔗凤梨病原菌和玉米大斑病菌的抑菌活性较强，分别为83.37%和81.08%；其次，对辣椒炭疽病菌、茶轮斑病菌、贡柑链格孢菌、白绢病菌的抑菌率在60%～80%，而对甘蓝黑斑病菌、根腐病菌的抑菌率则均低于60%。

正丁醇萃取物对甘蔗凤梨病菌和玉米大斑病菌的抑菌活性较好，分别为81.52%和86.04%，对其余植物病原真菌的抑菌率均低于60%；而萃余物对8种植物病原真菌的抑菌率均较低（6%～60%）。

上述研究结果说明，黄皮叶甲醇提取物对植物病原真菌的抑制活性成分主要存在于石油醚萃取物中，同时也有小部分处于乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中。

据表4 可知，黄皮叶石油醚萃取物对8 种植物病原真菌、乙酸乙酯萃取物对6种植物病原真菌、正丁醇萃取物对2 种植物病原真菌的抑菌效果较佳，进一步测定3 种萃取物对相应植物病原真菌的毒力，追踪抑菌活性物质所在萃取层部位，结果见表5。石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物对玉米大斑病菌菌丝的毒力均为最高，EC50值分别为0.010 2、0.016 4、0.433 2 mg/mL。石油醚萃取物对根腐病菌的毒力最低，EC50值为0.744 1 mg/mL，对其余6 种植物病原真菌的EC50值则为0.078 3～0.441 8 mg/mL；乙酸乙酯萃取物对除玉米大斑病菌外其余5 种相应植物病原真菌的EC50值为0.636 9～1.552 0 mg/mL；正丁醇萃取物对甘蔗凤梨病菌的EC50值则为1.666 2 mg/mL。

表5 黄皮叶提取物各萃取物对植物病原真菌菌丝的毒力Tab.5 Virulence of different extracts from crude extracts of Clausena lansium leaves on hypha of plant pathogenic fungi

2.5.2 对动物病原细菌的抑制活性 由表6 可知，黄皮叶甲醇提取物的石油醚萃取物及乙酸乙酯萃取物（5 mg/mL）对9 种动物病原细菌的生长均有抑制效果，其中石油醚萃取物对9 种动物病原细菌的MIC 为0.156 3～1.250 0 mg/mL，均低于或等于乙酸乙酯萃取物（0.625 0～2.500 0 mg/mL），表明黄皮叶甲醇提取物的石油醚萃取物对动物病原细菌的抑制活性优于乙酸乙酯萃取物。

表6 黄皮叶提取物各萃取物对9种动物病原细菌的抑制活性及MICTab.6 Inhibitory activities and MIC values of different extracts from crude extracts of Clausena lansium leaves on nine animal pathogenic bacteria

续表6 黄皮叶提取物各萃取物对9种动物病原细菌的抑制活性及MIC值Tab.6（Continued） Inhibitory activities and MIC values of different extracts from crude extracts of Clausena lansium leaves on nine animal pathogenic bacteria

3 结论与讨论

本研究报道了23 种植物的甲醇提取物对8 种植物病原真菌和9种动物病原细菌的抑菌活性初筛结果，并对初筛后抑菌效果较好的植物进行复筛。结果显示，黄皮、杨梅、五爪金龙、苏门白酒草、假臭草、商陆6 种植物甲醇提取物对植物病原真菌具有较好的抑制活性，黄皮叶甲醇提取物对8 种供试植物病原真菌的抑菌率均在60%以上。刘序铭等[31]研究结果说明，黄皮植株甲醇提取物对香蕉炭疽病菌、白菜黑斑病菌、玉米茎基腐病菌等12 种病原真菌具有抑制活性，结合本研究结果，黄皮叶甲醇提取物对病原真菌具有一定的抑菌广谱性。后续研究发现，黄皮叶甲醇提取物的石油醚萃取物对8 种植物病原真菌的抑菌率显著高于其他3 种萃取物，乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物对甘蔗凤梨病菌和玉米大斑病菌2 种植物病原真菌的抑制活性较佳，萃余物对8种植物病原真菌的抑制率均较低。

黄皮、杨梅、蟛蜞菊、假臭草、苏门白酒草、五爪金龙等15 植物甲醇提取物对至少1 种动物病原细菌的生长具有抑制活性，其中黄皮叶甲醇提取物对9 种动物病原细菌均有抑制作用。赵丰丽等[32]研究结果显示，黄皮叶提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MIC 均小于4 mg/mL，这与本研究结果相符，本研究中黄皮叶甲醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MIC分别为0.625、2.5 mg/mL。后续研究结果表明，黄皮叶甲醇提取物的石油醚萃取物对9种动物病原细菌的MIC 为0.156 3～1.250 0 mg/mL，其抑菌活性明显优于乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物。

综上，在对23 种植物的抑菌活性初筛中，黄皮叶甲醇提取物对8 种植物病原真菌和9 种动物病原细菌的综合抑菌效果最优，复筛中黄皮叶甲醇提取物的石油醚萃取物综合抑菌活性最强。当前，国内外对黄皮的研究报道多集中于黄皮成分在食品防腐保鲜、医用保肝促智、抗氧化、药用降糖降脂等方面，其综合性研究尤其在农业领域的研究还需进一步重视[33-37]。本研究结论为合理利用黄皮资源，将黄皮叶活性成分研制为新型有效的植物源抑菌剂提供了科学依据，对解决目前农业病害危害严重、化学防治残留污染大等问题具有重要意义。本研究虽只对综合抑菌效果最佳的黄皮叶甲醇提取物做了深入的研究，但杨梅、苏门白酒草、假臭草等植物提取物也具有深入研究并开发为有效植物源抑菌剂的潜力。