含ACC 脱氨酶的植物促生菌对金铁锁种子萌发的影响

李 茜，贾 颜，李新艺，李芹梅，刘 松，王梦雨，黄海泉，黄美娟

（西南林业大学 园林园艺学院/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心/西南林业大学 园林园艺花卉研发中心，云南 昆明 650224）

金铁锁（Psammosilene tunicoides）为石竹科金铁锁属的多年生植物，又名独定子、昆明沙参等，是中国西南地区特有的单种属植物，喜紧实、干燥且贫瘠的石灰岩土或红壤，主要分布于四川、云南及贵州等地[1-2]，该植物于1991年被《中国植物红皮书》列为珍稀濒危物种[3]。金铁锁具有重要的药用价值，其根为珍贵的中药材，具有散瘀、止血、消炎、祛风湿等功效，主治跌打损伤、胃痛、风湿痛、创伤出血等，为云南白药、贵州金骨莲胶囊等中药的主要成分之一[4]。因金铁锁野生资源分布狭窄，再加上长期无节制的挖掘，其物种数量急剧下降，已成为我国珍稀濒危植物。目前，金铁锁市场需求与日俱增，人工种植已成为栽培繁育的趋势。

植物促生菌（Plant growth-promoting bacteria，PGPB）是对植物有益的微生物的统称[5]，含ACC 脱氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase）的PGPB 能将乙烯直接前体物ACC 裂解成α-丁酮酸和氨，降低植物体内乙烯的合成，从而促进植物次生代谢产物产生[6]、增强植物抗性[7]、促进植物生长[8]，进而提高农作物产量和品质等[9]。杨亚茹等[10]研究发现，以荧光假单胞菌制备的DLJ1发酵菌液对小麦和油菜种子的萌发具有显著的促生能力。卢玉君等[11]采用不同砂生槐根瘤菌对青稞种子进行促生处理，萌发率最高可达到100%。张凯晔等[12]研究发现，从田菁种子中分离获得的具ACC 脱氨酶的内生细菌可促进田菁种子萌发生长。将含ACC 脱氨酶的PGPB 应用到农业生产中具有广阔的前景，也是国内外研究的热点之一[13]。目前，关于含ACC 脱氨酶的PGPB 对金铁锁种子萌发的影响研究还未见报道。鉴于此，以含ACC 脱氨酶的不同PGPB 菌株对金铁锁种子进行浸种处理，筛选对金铁锁种子具有良好促生效果的菌株，为下一步微生物菌肥的开发利用以及扩大金铁锁的繁育规模提供基础数据及理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试种子 试验所用金铁锁种子购买于云南省药材市场，置于常温储藏室保存待用。

1.1.2 供试菌株 试验所用菌株为西南林业大学园林园艺学院实验室前期分离筛选而来的4 株具ACC 脱氨酶活性的PGPB，将其分别编号为F195（假单胞菌属）、Z24（寡养单胞菌属）、Z39（芽孢杆菌属）、Z89（芽孢杆菌属），4个菌株混合后编号为Mix，将上述4个菌株及其混合菌株作为试验用菌。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理 首先挑取颗粒饱满、大小一致、外表无受损的种子，用无菌水冲洗30～40 min，去掉种子表皮的污垢和尘埃；用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3 次；用次氯酸钠消毒2.5 min，无菌水冲洗4次。

1.2.2 菌液制备 将试验菌株在无菌环境下分别转接于50 mL TSB 培养基中，混匀后放置28 ℃摇床中暗培养24 h，将培养好的菌液置于4 ℃低温离心机中，8 000 r/min 离心15 min。弃上层液体，收集菌体，将菌体分别与纯水混匀。将4个菌株以1∶1∶1∶1与50 mL 纯水混匀制成Mix。上述PGPB 菌液OD600均为0.05。

1.2.3 试验设计试验共设6 个处理，分别以无菌水（CK）、F195、Z24、Z39、Z89 菌株和Mix 混合菌株进行处理。每个处理设置3 个重复，每个重复30 粒种子。将消毒处理后的金铁锁种子置于无菌滤纸上，吸干水分后，分别置于无菌培养皿中（放置2层无菌滤纸，加入5 mL 菌液湿润）。将培养皿置于相对湿度75%、25 ℃的培养箱中进行发芽试验。每隔1 d更换1 次滤纸，并加入5 mL 新鲜菌液，所有操作在无菌条件下进行。以种子胚芽突破种皮为萌发标准，每天观测并记录1次萌发生长情况。

1.3 测定指标与方法

发芽指标测定：发芽率、发芽势、发芽指数、日平均发芽率、活力指数、第1 粒种子萌发天数、种子萌发高峰期和平均发芽天数的计算参考杨亚茹等[10]和邹成林等[14]的方法。吸水指标测定：吸水百分率的计算参考马洁等[15]的方法。幼苗生长指标测定：每个处理挑取8 株长势较好的幼苗进行根系长度、胚芽长度、幼苗鲜质量和幼苗干质量的测定[14]。使用游标卡尺对根系长度和胚芽长度进行测量；将幼苗置于80 ℃烘箱中烘干，使用电子天平称量幼苗鲜质量和幼苗干质量。指标测量结果为各个处理的平均值。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2019 软件对数据进行统计，使用SPSS 23.0 软件进行多因素方差分析，使用Origin 2018进行主成分与聚类分析。

2 结果与分析

2.1 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子萌发特性的影响

从表1 可知，经含ACC 脱氨酶的不同PGPB 菌株处理后，F195、Z24、Z39 和Mix 处理的种子萌发指标显著高于CK（P＜0.05）。F195、Z24、Z39 和Mix 处理的发芽率与CK 相比，分别提高了32%、24%、10%、15%；F195 处理的发芽势最高，为74.44%，比CK 提高了49%，其次是Z24、Z39 和Mix 处理，发芽势分别比CK提高了29%、18%、24%；F195、Z24、Z39和Mix 处理的发芽指数与CK 相比，分别提高了223%、179%、76%、145%；F195、Z24、Z39 和Mix 处理的日平均发芽率与CK 相比，分别提高了32%、24%、10%、15%。同时，不同PGPB 菌株处理在金铁锁种子的活力指数上也存在显著差异（P＜0.05）。其中，F195 处理的活力指数最高，为56.20，比CK 提高了358%；其次是Z24、Z39 和Mix 处理，分别比CK提高了210%、80%、155%。由此可见，含ACC 脱氨酶的F195、Z24、Z39 和Mix 菌株对金铁锁种子萌发具有明显的促进作用。其中，F195 菌株处理效果最佳。

表1 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子萌发特性的影响Tab.1 Effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on germination characteristics of P.tunicoides seeds

2.2 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子发芽时间的影响

由表2 可知，经F195、Z24、Z39 和Mix 菌株处理后金铁锁种子的第1粒种子萌发天数明显短于CK，分别比CK 提前3、2、1、1 d 萌发；Z89 处理比CK 晚1 d萌发，处理效果不佳。F195和Z24处理均在14 d达到萌发高峰期，比CK 提前2 d。F195 处理金铁锁种子平均发芽天数最短，为8.30 d；Z89 处理金铁锁种子平均发芽天数最长，为8.95 d，增加了种子平均发芽天数。综上可知，F195、Z24、Z39 和Mix 处理对金铁锁种子萌发有促进作用，而Z89 处理有抑制作用。其中，促进金铁锁种子萌发效果最佳的菌株为F195，Z24菌株次之。

表2 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子发芽时间的影响Tab.2 Effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on germination time of P.tunicoides seeds

2.3 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子吸水百分率的影响

从图1 可知，经含ACC 脱氨酶的不同PGPB 菌株处理后，金铁锁种子吸水百分率均呈先上升后趋于平稳趋势。处理24～32 h 金铁锁种子吸水百分率急剧增长，处理40 h 吸水速度趋缓。处理48 hF195、Z24、Z39和Mix处理的金铁锁种子吸水百分率与CK 呈显著性差异（P＜0.05），分别比CK 高出80%、44%、13%、27%；而菌株Z89 处理的吸水百分率比CK 低14%。综合比较来看，菌株F195、Z24、Z39 和Mix 处理能够有效提高金铁锁种子吸水百分率。

图1 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子吸水百分率的影响Fig.1 Effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on water absorption of P.tunicoides seeds

2.4 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁幼苗生长的影响

由图2A、2B 可知，经含ACC 脱氨酶的不同菌株处理后，金铁锁根系长度和胚芽长度与CK 相比存在显著性差异（P＜0.05），且随着处理时间的延长，根系长度和胚芽长度的总体变化一致，均呈上升趋势。其中，F195 处理随着时间的推移，其根系长度和胚芽长度与CK 相比，每个时间点分别提高了63%、65%、69%、60%、71%和63%、55%、34%、42%、55%。Z89 处理的根系长度和胚芽长度上升较缓慢，一直处于较低水平，且总体波动不大；而其他处理则在CK 与F195 处理之间波动，其根系长度和胚芽长度一直随时间的延长而递增，且Z24和Mix处理表现较为相似。由此可以看出，在促进金铁锁幼苗的根系长度和胚芽长度增加，从而促进幼苗生长方面，F195菌株处理最佳，Z24和Mix菌株处理次之。

从图2C、2D 可知，不同菌株处理的幼苗鲜质量和干质量与CK 相比差异显著（P＜0.05）。其中，F195处理的幼苗鲜质量和幼苗干质量效果最好，分别比CK 提高76%、131%；其次为Z24 和Mix 处理，其幼苗干、鲜质量均呈现相似的变化趋势；而Z89处理的幼苗鲜质量和幼苗干质量仍然处于较低水平。由此可见，F195、Z24、Z39 和Mix 菌株对金铁锁幼苗的鲜质量和干质量具有促进作用，而Z89 菌株则抑制了幼苗的干、鲜质量。综上，促进金铁锁幼苗干、鲜质量增加效果最佳的菌株为F195，Z24和Mix次之。

图2 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁幼苗生长的影响Fig.2 Effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on seedling growth of P.tunicoides

2.5 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子萌发生长影响的综合性评价

2.5.1 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子萌发生长影响的主成分分析 对含ACC 脱氨酶的不同PGPB 菌株处理的金铁锁种子的11 个萌发生长指标进行主成分分析，可以综合反映不同PGPB 菌株对金铁锁种子萌发促生的影响。共提取1 个主成分（PC1），其贡献率为89.82%，累计贡献率为89.82%（表3）。其中，胚芽长度（0.317）、根系长度（0.316）、发芽率（0.316）、日平均发芽率（0.316）及活力指数（0.315）在主成分1 中载荷较高。因此，胚芽长度、根系长度、发芽率、日平均发芽率和活力指数可作为评价不同PGPB 菌株对金铁锁种子萌发生长影响的重要指标。

表3 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子萌发生长影响的主成分分析Tab.3 Principal component analysis of the effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on seed germination and growth of P.tunicoides

2.5.2 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子萌发生长影响的聚类分析 为进一步确定含

ACC 脱氨酶的不同PGPB 菌株在金铁锁种子萌发生长方面的效果，对不同处理下萌发生长指标进行聚类分析（图3）。可以看出，在欧氏距离为34 时，可以将不同的菌株聚为3 类。其中，萌发效果较好的F195 菌株为第Ⅰ类，萌发效果中等的Z24、Mix 和Z39 菌株为第Ⅱ类，萌发效果较差的Z89 菌株为第Ⅲ类，说明含ACC 脱氨酶的PGPB 菌株在不同程度上能促进金铁锁种子萌发生长。其中，F195菌株处理效果最好。

图3 含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子萌发生长影响的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of the effeit of different PGPB strains containing ACC deaminase on seed germination and growth of P.tunicoides

3 结论与讨论

研究表明，具ACC 脱氨酶活性的PGPB 依附在种子表皮时，可通过合成ACC 来调节植物中乙烯的水平，尤其是在播种后的几天，不仅可以促进植物的萌发，还可提高植物幼苗的成活率[16-19]。本研究通过用前期筛选出的含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株对金铁锁种子进行浸种处理发现，其对金铁锁种子萌发及幼苗生长的影响存在显著性差异（P＜0.05）。

种子发芽率是衡量种子质量好坏的首选指标，种子发芽势是鉴别种子发芽整齐度的主要指标，以上指标都是验证种子发芽的重要指标[20]。本研究发现，含ACC 脱氨酶活性的PGPB 菌株对金铁锁种子的发芽率、发芽势和发芽指数等均有明显促进作用，与宋发军等[21]和杨亚茹等[10]的试验研究结果一致，这可能是PGPB 接触种子后，不仅降低了乙烯水平，还提高了植物体内分裂素和生长素的代谢，从而促进萌发[13]。种子吸水特征是反映种子生长最重要的指标，也是对外源环境最敏感的时刻[22-23]。F195、Z24、Z39 和Mix 菌株对金铁锁种子的吸水百分率均有促进作用，种子吸水百分率增加后，可以增强金铁锁种子抗胁迫能力，进而提高发芽效果。其中，F195菌株处理效果最为明显。主成分分析结果显示，发芽率、日平均发芽率及活力指数等在主成分1中均具有较高载荷，表明发芽率、日平均发芽率及活力指数等可作为评价金铁锁种子萌发效果的重要指标。

植物形态是反映植物长势的重要指标，可明显反映出不同处理对植物生长的影响[24]。在本研究中，种子萌发，继续被含ACC脱氨酶活性的PGPB菌株处理，金铁锁幼苗的根系长度、胚芽长度、幼苗鲜质量和幼苗干质量均呈上升趋势，表明含ACC 脱氨酶活性的PGPB 菌株对幼苗的生长具有促进作用，与谭佳缘[25]采用碱蓬内生菌EF0802 对水稻幼苗的促生研究结果一致。这可能是随着种子萌发，植物根际中会短暂分泌ACC，而含ACC 脱氨酶活性的PGPB 菌株利用ACC 作为氮源生长，增强活性能力，从而加快植物地上部分和地下部分的生长[11]。不同的菌株处理可以在不同程度上使金铁锁幼苗的根系长度、胚芽长度、幼苗鲜质量和幼苗干质量增加，从而提高植物长势，特别是F195菌株对金铁锁幼苗的促进效果极为显著。主成分分析结果表明，胚芽长度和根系长度在主成分1 中载荷较高，由此可以看出，胚芽长度和根系长度可作为评价金铁锁幼苗生长的重要指标；同时聚类分析结果表明，促进效果最为显著的F195 菌株单独聚为一支。以上研究表明，F195菌株在促进金铁锁种子萌发生长进程中起到重要作用。

本研究结果表明，含ACC 脱氨酶活性的PGPB菌株能有效促进金铁锁种子的萌发及其幼苗的生长。目前，国内外对具ACC 脱氨酶活性的PGPB 相关研究主要集中于促进植物生长、增强植物抗性以及促进植物次生代谢产物发挥功能等方面[26]。SHIVSING 等[27]从杂交玉米PEEHM-5 和复合PC-4中分离出含ACC 脱氨酶活性的内生细菌，并进行了地上部和根系试验后发现，使用含ACC 脱氨酶活性的菌株可以减少近25%的化肥投入。BARNAWAL等[28]研究表明，含ACC 脱氨酶的假单胞菌可以提高罂粟对棉铃虫、霜霉病的耐性。漫静等[29]从羊草根际中分离出了含ACC 脱氨酶活性的内生细菌，并发现其对羊草生长均具有促进作用。由此可知，深入研究具ACC脱氨酶的PGPB对农业可持续发展具有重要的现实意义。

综上所述，含ACC 脱氨酶的不同PGPB 菌株对金铁锁种子萌发及生长的影响存在一定差异，说明适宜的菌株能在较短时间内促进种子萌发及其幼苗生长，进一步提高人工育苗效率。因此，对于不同作物可探讨不同植物促生菌的促生效果，为微生物菌肥的开发利用及作物的高效栽培技术提供基础数据和理论依据。