黄缘闭壳龟头骨、椎骨及附肢骨骼系统研究

张钰伟，戴世明，赵旺，邓正华，黄星美，温为庚，马振华*

(1. 中国水产科学研究院南海水产研究所， 农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室， 广东 广州 510300；2. 三亚热带水产研究院， 海南 三亚 572426； 3. 天津农学院， 天津 300384)

黄缘闭壳龟(Cuoraflavomarginata)隶属龟鳖目，龟科，闭壳龟属，又名黄缘盒龟，栖息于丘陵山区靠近水源的林缘、杂草、灌木之中，为亚洲特有物种，主要分布于江苏、安徽、河南、江西、浙江、广西、福建、台湾等地[1-2]。黄缘闭壳龟不仅是传统名贵中药材，而且观赏价值高，深受养龟爱好者的喜爱，极具市场潜力[3]。人们对野生黄缘闭壳龟滥捕滥杀，以及人类活动导致自然环境日益恶化，黄缘闭壳龟的栖息地不断遭到破坏，使得其野生资源濒临灭绝，1998年列为中国国家珍稀濒危动物[4]。因此，对黄缘闭壳龟进行大规模养殖和开发利用成为国内外养殖者的共同目标，黄缘闭壳龟人工养殖技术的开展，使这一珍稀濒危动物得到有效保护。目前，国内外对黄缘闭壳龟的研究已逐渐深入。国内主要涉及到黄缘闭壳龟的地域性资源调查[5-9]、养殖[10-13]、通径分析[14]、病害[15-17]和遗传生物学[18]等多个方面，而对于黄缘闭壳龟骨骼相关的研究并未见报道。

动物骨骼研究的方法通常采用肌肉透明骨骼染色法、蒸煮剔骨法、X射线透视法等[19-21]。龟是一种难以用普通的解剖方法进行骨骼研究的生物，龟类骨骼研究目前仅有两种方法，一是根据现有的四爪陆龟(TestudohorsfieldiGray)的标本进行解剖观察，此方法局限性大，仅限于已死亡的动物标本，并且在收集储存标本的过程中难免会有部分细小骨骼丢失[22]；二是制作透明标本的方法,与肌肉透明骨骼染色法类似，此类方法适用于幼体骨骼发育不完全且个体较小的生物，但对于成年个体，骨骼已充分发育，此方法并不适用[23]。以上方法均需要失去生命迹象的实验对象，并不能连续记录同一个实验对象生长过程中骨骼发育情况，而X射线透视法则可以进行活体研究。X射线是一种频率高、波长短、能量仅次于伽马射线的强大电磁波，不受电场和磁场的影响，具有穿透物质的能力，但受密度影响，对不同物质的穿透能力强弱不一，经过最终的显像处理后能够得到不同的影像。因此，X射线透视法目前广泛应用于人体健康检查，在龟类骨骼研究和龟类疾病检查方面并未被应用[24-26]。采用X射线透视法可以在不损伤龟体的前提下简单高效地观察整个龟体骨骼特征及其分布特征，对活体濒危或者珍贵物种的骨骼研究及其相关疾病诊断治疗具有重要的意义，缺点是当骨骼重叠部分过多时，如头部和龟类的躯干部重叠，并不容易观察其细节。

本研究运用X射线透视法对黄缘闭壳龟的头骨、椎骨、前肢骨、后肢骨等进行描述，进一步丰富黄缘闭壳龟的基础研究数据，并为开展黄缘闭壳龟相关研究及龟类化石探究提供最佳的参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

研究对象为黄缘闭壳龟，养殖于中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心。

1.2 实验仪器

数字化移动式摄影X射线机(Modulo Easy 30,SMAM S.R.L.)。X射线背景板(Pixium 3543EZ，法国泰雷兹集团)。

1.3 方法

设备开机预热并设置参数(kVp=40，mAs=3.2)。将黄缘闭壳龟放置于背景板上,同时置于X射线发射端口下，并调整龟体至射线可以完全覆盖，待黄缘闭壳龟放松将头部、四肢和尾巴伸展出壳时，开始拍摄(过程中注意个人防护)，扫描完成后将黄缘闭壳龟放回养殖箱，整个过程不超过35 s。

1.4 数据计算和统计分析

将黄缘闭壳龟置于白色桌面上，在其身边放置一把刻度尺，并在其正上方进行拍照。照片均使用Photoshop 2020 软件进行图片处理，添加标注线，根据照片中刻度尺刻度测量颅长、颅宽、背甲长及背甲宽，并用ImageView软件测量下颌骨夹角。

2 结果

2.1 背腹甲形态特征

黄缘闭壳龟背腹甲形态特征如图1所示，头部细长，表面光滑无鳞片，头部背面为浅橄榄色，两眼后各有一条米黄色带状条纹，在颈部交汇成“U”形，腹面为黑色或灰黑色。背甲呈卵圆形，棕红色，高而隆起，每片盾甲最中间的同心纹路呈黄色，椎盾中间有一条黄色嵴棱，缘盾略微上翘。缘盾和肋盾以嵴棱为中心线呈对称分布，单侧缘盾12块，肋盾5块，缘盾腹面和甲桥呈现米黄色。

图1 黄缘闭壳龟背腹甲特征1. 颅宽；2. 颅长；3. 背甲长；4. 背甲宽；5. 颈盾；6. 椎盾；7. 缘盾；8. 肋盾；9. 臀盾；10. 喉盾；11. 肱盾；12. 胸盾；13. 甲桥；14. 腹盾；15. 股盾；16. 肛盾。Fig.1 Carapace characteristics of Cuora flavomarginata1. Skull width; 2. Skull length; 3. Carapace length; 4. Carapace width; 5. Nuchal shield; 6. Vertebral shield;7. Marginal shield; 8. Ribs shield; 9. Breech shield; 10. Larynx shield; 11. Brachial shield; 12. Chest shield; 13. Bridge; 14. Venter shield; 15. Thigh shield; 16. Anus shield.

腹甲黑色或灰黑色，呈卵圆形，上小下大，腹甲从前到后依次为喉盾、肱盾、胸盾、腹盾、股盾和肛盾。喉盾位于最前端中间，夹在肱盾之间，胸盾和腹盾与缘盾相连形成甲桥。胸盾和腹盾之间靠铰链韧带相连，可以使腹甲上端(喉盾和肱盾)、下端(股盾和肛盾)与背甲完全闭合，头、尾和四肢可完全缩入壳内。

2.2 头部骨骼特征

龟类种类繁多，头骨形态特征不一，黄缘闭壳龟头部X光照片可清晰地呈现头部的主要骨骼结构(见图2)。面区狭而短，眼后方骨位置最宽，具有类似颞窝的颞窝凹陷。整个头骨窄而细长，与身体占比小，黄缘闭壳龟外部形态性状测量统计结果如表1所示，颅长为背甲长的27.09%～30.93%，颅宽为背甲宽的21.40%～27.66%，颅长为颅宽的1.35～1.72倍。

图2 黄缘闭壳龟头部骨骼X光照片及头部实体照片(背侧观)1.前额骨；2.前颌骨；3.上颌骨；4.下颌骨；5.眼窝；6.顶骨；7.前耳骨；8.方骨；9.后耳骨；10.枕髁；11.枕骨嵴；12.下颌骨夹角。Fig.2 X-ray photographs of head bones and real head picture of Cuora flavomarginata (Dorsal view)1.Forehead;2.Premaxillary;3.Maxilla;4.Mandible;5.Eye socket;6.Parictal bone;7.Prootic;8.Quadrate;9.Opisthotic;10.Occipital condyle;11.Occipital crest；12.Mandibular angle.

前颌骨是位于头骨最前方的一对小骨，侧面连接上颌骨，作为鼻腔的底壁和上口盖的前缘。额骨位于顶骨和前额骨之间，由于层面固定并不清晰。眼窝位于顶骨两侧，在X射线照片下呈现明显的轮廓虚影。方骨为一对，在头部最宽处方轭骨偏后的位置，两块方骨与头部长轴成轴对称，外部形成喇叭状的鼓室壁，喇叭口为鼓膜所覆盖。前耳骨位于方骨和顶骨之间，后部位置为后耳骨，接近上枕骨。下颌骨呈现“V”字形，夹角为55.32～64.52°(见表1)，位于头部的下侧，比上颌骨略小，下颌骨与上颌骨闭合时，形成研磨面，用于咀嚼吞咽食物。

表1 黄缘闭壳龟外部形态性状测量统计结果Tab.1 Statistical results for external morphological traits of Cuora flavomarginata

2.3 椎部骨骼特征

脊椎骨共34或36枚(见图3)。颈椎共4枚，细长，处游离状态与背甲不愈合，无颈肋。第四颈椎后连接着躯椎，即从第5枚椎骨开始分为躯椎和肋骨，共7枚，第四颈椎和第一躯椎连接处较为粗大，与前肢肩胛骨相连接。第一躯椎开始特化变粗，第三躯椎最粗最宽，后第四躯椎开始到第七躯椎，椎骨逐渐变短变窄。第1～7躯椎两侧连接着肋骨，肋骨宽度大小与躯椎的宽度相近[22]，最后两枚躯椎所连接的肋骨宽度较窄。第七枚椎骨后连接荐椎，较为短小，数量为2至3枚，后连接尾椎。尾椎最为细小，数量最多，为21或22枚。

图3 黄缘闭壳龟椎部骨骼X光照片(背侧观)1.第一颈椎；2.第四颈椎；3.第一躯椎；4.第三躯椎；5.第七躯椎；6.荐椎；7.尾椎；8.肋骨；9.肋骨宽；10.躯椎宽。Fig.3 X-ray photographs of Cuora flavomarginata vertebrae (Dorsal view)1.First cervical vertebrae;2.Fourth cervical vertebrae;3.First trunk vertebrae;4.Third trunk vertebrae;5.Seventh trunk vertebrae;6.Sacral verebrae;7.Coccygeal vertebrae;8.Rib;9.Rib width;10.Trunk vertebrae width.

2.4 附肢骨骼特征

2.4.1 前肢骨

如图4所示，肱骨较为粗壮，状若弓形，两头粗大，中部靠近肩胛骨位置偏细小，横截面近似圆形。肱骨末端与尺骨和桡骨相连接，尺骨与桡骨相比略微粗壮。桡骨和尺骨两端粗大中间细窄，尺骨靠近肱骨端更粗大，略微弯曲，尺骨和桡骨并列，中间形成一条长形缝隙，末端连接腕骨，有多枚，细小，形状不规则，与掌骨相连。掌骨与指骨连接，末节指骨较长并支持角质爪，为五爪。

图4 黄缘闭壳龟附肢骨骼X光照片1.头骨；2.颈盾；3.肱骨；4.尺骨；5.桡骨；6.指骨；7.掌骨；8.腕骨；9.脊椎骨；10.股骨；11.臀板；12.尾椎；13.缘盾；14.腓骨；15.胫骨；16.跗骨；17.跖骨；18.趾骨。Fig.4 X-ray photographs of Cuora flavomarginata appendicular skeleton1.Skull;2.Nuchal shield;3.Humerus;4.Ulna;5.Radius;6.Phalanges;7.Metacarpal;8.Carpale;9.Vertebral bone；10.Femur；11.Pedical plate；12.Coccygeal vertebra;13.Marginal shield;14.Fibula;15.Tibia;16.Tarsus;17.Metatarsal;18.Phalanges.

2.4.2 后肢骨

股骨、腓骨、胫骨、跖骨、跗骨和趾骨构成后肢骨。耻骨、坐骨和髂骨由于层面不一、龟甲和组织的干扰，X射线照片并不能清晰显示。股骨状若号角，略有弯曲，两端粗大，股骨略短于肱骨，前端与耻骨、坐骨和髂骨相连，末端连接胫骨和腓骨。胫骨和腓骨比尺骨和桡骨细长，胫骨比腓骨略显粗大，两根骨骼均两端微隆，腓骨和胫骨并列，间有空隙。腓骨和胫骨末端连接跗骨，多枚，较为细小，形状不规则。跖骨前端连接跗骨，末端连接趾骨，趾骨细长，为四爪。

3 讨论

3.1 背腹甲形态特征

龟鳖目在爬行纲中最为特化，背腹具壳，是一种被动的保护性适应，龟类种类繁多，形态特征不一，背腹甲的形状与其栖息的生存环境有关[27]。陆生龟背甲相对饱满，高而偏圆；水生龟背甲较扁平，呈流线型[28-29]。黄缘闭壳龟为水陆两栖龟类，背甲微隆，有同心纹路，触感光滑，其背甲形态介于高圆型和扁平流线型之间，能够承受较大的机械力。腹甲的形成远早于背甲，是龟类自我保护机制不可或缺的一部分，主要起着保护腹部的作用[30-31]。黄缘闭壳龟行动迟缓，为闭壳龟属，胸盾和腹盾之间的铰链结构被认为是一种反捕食适应，面临危险或者惊吓时，头、尾和四肢均可完全缩入壳内，其前端(喉盾和肱盾)和后端(股盾和肛盾)腹甲分别与背甲闭合，将肉体完全封闭保护起来，很少有动物能对他产生致命威胁，因此黄缘闭壳龟在自然界的天敌很少，幼龟时期蛇类和猛禽威胁最大。如今因人类的过度捕杀以及其生存环境的破坏，黄缘闭壳龟野生资源濒临灭绝[7]。

3.2 头部骨骼特征

黄缘闭壳龟作为两栖龟类，头骨大小介于陆生龟和水生龟类之间[32-33]，头部窄长，整体呈现卵圆形，且头骨与身体占比较小，头部收缩自如，方便黄缘闭壳龟捕食和反捕食[7]。黄缘闭壳龟属杂食性龟类，其头盖骨和研磨面偏小。研究表明龟类头骨的高度与咬合力呈正相关，以贝类和植物为食的龟类头盖骨高而大，上颌骨和研磨面比杂食性龟类大[34]。黄缘闭壳龟的眼窝位于头骨两侧，上端肌肉微隆，对眼球具有良好的保护作用，眼球微凸增加了黄缘闭壳龟的视域面积，提高了其发现猎物的概率和捕食能力，同时也有利于观察四周，及时发现危险，关闭龟壳反捕食。

3.3 椎部骨骼特征

本研究中黄缘闭壳龟脊椎骨共有34或36枚，其中颈椎4枚，躯椎7枚，荐椎2或3枚，尾椎21或22枚。研究表明，脊椎骨是构成龟类骨骼系统的重要组成部分，不同龟类脊椎骨的数量和结构不尽相同，例如：四爪陆龟的脊椎骨共39或42枚，其中颈椎9枚，躯椎10枚，荐椎2枚，尾椎18或21枚；巴西红耳龟(Trachemysscriptaelegans)骨骼观察所使用方法为肌肉透明骨骼染色法，由于龟壳的遮挡，颈椎无法看清，其尾椎有20枚左右[22-23]。黄缘闭壳龟与上述两种龟类脊椎数量不尽相同，其中四爪陆龟属陆生龟，巴西红耳龟属半水栖、半陆栖，而黄缘闭壳龟属两栖龟类，由于生境及食性的差异，受系统发育的影响，龟类的形态进化出现多样化，通过自然选择，优胜劣汰，不同生境的龟类形态出现差异，因此其骨骼也存在差异[35]。

3.4 附肢骨骼特征

不同生境中龟类的四肢骨骼存在差异。陆生龟类前肢骨比水生龟的短，而陆生龟的四肢呈管状，水生龟的四肢为扁平状，说明陆生龟类前肢骨的尺骨、桡骨之间和后肢骨的腓骨、胫骨之间的空隙比水生龟类的空隙小，并且在陆地支撑着厚重高耸的龟壳，陆生龟的骨骼更粗壮，而水生龟类的四肢骨骼较为细长，尺骨、桡骨之间和腓骨、胫骨之间的空隙较大[36-37]。本研究中，黄缘闭壳龟属于两栖龟类，其前肢骨长而较粗壮，而后肢骨较短并且比前肢骨扁平，说明黄缘闭壳龟尺骨、桡骨之间的空隙比腓骨、胫骨之间的空隙大。Lindeman等[38]研究发现，矩斑图龟(Graptemysouachitensis)和滑鳖(Apalonemutica)为河流型物种具有较长的四肢和指(趾)。黄缘闭壳龟的指骨、趾骨和跖骨比陆生龟类的长，掌骨较为扁平，前掌为五爪，后掌为四爪，在陆地上爬行时主要依靠前肢骨支撑身体。

4 结论

综合以上骨骼研究发现黄缘闭壳龟具有与生活习性相匹配的骨骼结构，头骨和背甲呈卵圆形，头部与身体占比小，头部收缩自如，方便捕食和反捕食；前肢骨比后肢骨长而粗壮，可以支撑其在陆地活动，背腹甲可闭合又为其安全提供保障，符合野外生存的特性。同时也证明X射线透视法可以较为清晰地观察黄缘闭壳龟的骨骼结构，但由于物种特性，龟类背腹甲的影响，躯椎、荐椎和尾椎骨清晰度略低。X射线透视法可以实现无伤化龟类骨骼研究，并进一步丰富黄缘闭壳龟的基础研究数据，并为开展黄缘闭壳龟相关研究及龟类化石探究提供最佳的参考资料。