现代生物技术在植物源化妆品原料开发中的应用研究进展

赵平，王艳，赵力民

（广东药科大学医药化工学院，广东 广州 510006）

化妆品安全评估是化妆品消费安全的重要保障，化妆品功效评价是对化妆品功效宣称进行科学支持的有效手段。其中，化妆品原料是化妆品整个生命周期的源头，承载着化妆品的主体，其安全和功效情况直接影响化妆品成品的安全与有效性[1]。我国是世界上植物资源最丰富的地区之一，拥有数以万计的药用植物资源有待作为化妆品新原料开发。然而，“神农尝百草，一日而遇七十毒”，植物化学和毒理学研究表明，许多植物成分有明确的致癌性、致敏性、致畸性、光毒性以及由于外界环境污染等造成的外源性不安全因素等[2]。因此，中国特色植物化妆品原料的开发和应用，并非坦途。而传统“十年磨一剑”的药物研发模式，无法满足快速发展的化妆品行业对原料开发的需求速度，因此引入化学、信息科学、生命科学等学科中成熟便捷、广泛使用的技术手段来进行化妆品植物原料的开发具有重要意义。

目前，世界各国纷纷开展针对植物化妆品原料开发的技术手段研究，根据原料开发“自上而下”或“自下而上”地有序选择化学/信息/生物等一系列现代化技术形成“组合策略”，以最终实现通过单一方法或几种技术组合的策略来评价化妆品原料的安全和功效性。欧洲化妆品协会（Cosmetics Europe）发布化妆品功效评价指南等相关评价方法，欧洲化妆品及其他外用产品功效评价专家组（EEMCO）通过计算机模拟筛选优化等技术对植物化妆品的毒理安全性、刺激性及弹性、抗氧化性等功效进行了研究。韩国食品医药品安全评价院发布了部分植物化妆品的功效证实试验方法，细胞生物学和斑马鱼实验等现代生物技术被采用。在日本化妆品工业联合协会（JCIA）发布的化妆品抗老化、美白和防晒功效评价指南中，也将细胞生物学等现代生物技术方法应用其中。目前，这些方法在我国的应用尚未普及，我国植物源化妆品的开发技术革新还有很大的提升空间。

本文针对我国目前植物源化妆品原料开发方法现状，介绍了计算机辅助药物设计、细胞生物学和斑马鱼模型等现代生物技术在该领域的应用，期望对新原料的开发起到积极的参考作用。

1 植物源化妆品原料开发领域的现状分析

1.1 我国植物源潜在化妆品原料资源丰富，安全与功效筛选评估压力巨大

在我国新颁布的2021版《已使用化妆品原料目录》中，有3 115种属于植物源功效原料。然而，截至目前，我国境内已知36 512种高等植物物种，其中11 118种有药用记载。因此，化妆品植物原料目录还有很大的扩充空间[3]。同时，庞大的潜在化妆品用植物原料的存在，对原料的筛选开发效率和安全功效评价技术提出了更高要求。植物原料的提取获得方式多样，成分错综复杂，天然提取物的固有味道、颜色、稳定性、成本等诸多因素，限制了其开发速率[4]。然而，目前年轻的化妆品消费人群对化妆品的要求理性而全面，对安全和功效性都有着较高标准。植物源化妆品原料的开发人员需要小心把握安全和功效这柄双刃剑，为消费者带来可以被实际感受到的效果[5-6]。因此，植物源化妆品原料在化妆品行业的进入，需要大量的安全和功效评估数据的支撑，基于原料庞大的基数，进行这些测评工作的压力巨大。

1.2 国家对化妆品安全和功效评价的管理法规频出，日趋严格

化妆品是直接作用于人体皮肤，其安全性对消费人群的健康紧密相关。此外，化妆品作为高度依赖产品宣称的行业，其功效宣称与产品销量密切相关，直接影响到消费者权益和企业效益[7]。原料的安全性是化妆品产品安全的前提条件，活性原料的功效性是产品功效性的根本来源[8]。为保障《化妆品监督管理条例》的实施而制定的《化妆品安全评估技术导则》和《化妆品功效宣称评价规范》均规定，在注册备案化妆品新原料和成品前，必须开展安全评估；化妆品的功效宣称应当有充分的科学依据，企业对功效宣称负责，并应当将有关研究数据或功效验证材料在指定网站公开，接受社会监督[9]。频繁出台的法规和管理办法，充分展示了政府对整顿化妆品功效宣称混乱现象的决心，也对化妆品企业提出了严峻的考验。

1.3 化妆品原料的筛选和评估周期漫长，成本高昂

化妆品原料的安全功效筛选评估当前大多沿用传统的药物研发模式，各大评测机构对化妆品原料及产品的安全和功效评估广泛采用的是动物在体和志愿者主观评价配合客观仪器评估等方法，这些方法实施周期漫长，影响因素众多，评价标准制定难度较大，测试费用较高，人力物力成本较大[10]。因此，企业缺乏新原料研发的主动参与积极性。我国现有175家化妆品注册和备案检验检测机构，其中广东省仅有37家。由于缺乏高效的筛选和评估技术，未建立相应的化妆品功效评价方法和标准，上述机构所开展的基本是化妆品成品的安全与功效性方面的基本检测，目前尚未进行化妆品新原料开发和评估方面的探索。暨南大学等科研院校开展了部分的化妆品原料安全功效评估工作，但也不够高效和系统化。

2 现代生物技术在植物源化妆品原料开发与评价中的应用

目前，植物源化妆品原料的安全功效筛选评估大多沿用传统的“十年磨一剑”的药物研发模式，研发周期较长、投入成本较高，成功率低，耗时费力，不能满足快速发展的市场经济需求[11]。化学、药学、中药学、信息科学、生命科学等多学科手段灵活运用，协同助力，是未来化妆品新原料安全与功效评估的主要发展趋势[12]。其中，计算机辅助药物设计、细胞生物学体外替代实验以及斑马鱼模型等手段的交叉应用，将成为化妆品开发与评价方法的主导，见图1。

图1 植物源化妆品原料开发与评价方法示意图Figure 1 Schematic diagram of the development and evaluation method of plant-derived cosmetic raw materials

2.1 计算机辅助药物设计高效筛选植物源化妆品原料

计算机辅助药物设计思路可以实现对物质性质高效快捷的预测模拟筛选，目标靶点选用病理学、皮肤生理学相关蛋白，进行植物源化妆品潜在功效原料的开发工作。计算机辅助药物设计用于筛选植物源化妆品原料的方法一般分如下几步：（a)对《已使用化妆品原料名称目录》(2021版)中的植物源原料根据功效进行整理，构建植物源化妆品原料信息数据库[12]；（b）广泛参考国内外数据库、文献和网站，进一步对植物源化妆品原料中所含功效性化学成分结构建库[13]；（c）分析生理学作用靶点蛋白[14]；（d）通过药物与靶点作用模型，预测和筛选化合物的功效性成分，构建功效原料化合物库[15]；（e）通过生物化学和细胞实验对所预测的功效进行验证，并进一步进行人体功效评价，证实所需植物源化合物的功效性成分[16]。可用于计算机辅助筛选的软件详见表1。

表1 计算机辅助筛选软件Table 1 Computer-aided screening software

2.2 细胞生物学层面快速评价化妆品安全与功效

自2010年欧洲议会通过了修订关于动物替代实验3R原则以来，以细胞生物学为主的体外替代动物实验受到化妆品研发人员的广泛青睐。研究人员从细胞水平出发，利用分子生物学、遗传学、免疫学、生理学等方法深入地探究化妆品与细胞作用机理。相对动物活体实验，细胞实验的实验条件和实验对象可控性更强，成本更低，速度更快，也更易获得微观细胞生理指标数据，可以为体外实验和在体实验提供良好的补充和完善[17-18]。因此，通过对体外动物细胞进行培养来建立细胞模型，评价化妆品原料或成品的安全性和功效性，有望成为化妆品开发与研究领域的重要手段。

目前针对化妆品功效进行的细胞生物学评价方法主要有MTT，酶联免疫等。例如，Xiong等[19]采用MTT法和酶联免疫法联合对人参提取物刺激成纤维细胞增殖、成纤维细胞和角质形成细胞产生的透明质酸进行研究，判断皮肤的老化情况从而对化妆品的抗衰功效进行研究。在化妆品的美白评价方面，Chen等[20]通过体外培养黑素细胞或者按人体皮肤中的比例混合来培养黑素细胞与角质形成细胞以模拟人体皮肤结构和代谢过程，然后采用MTT比色法与细胞图像分析技术检测药用植物中黄酮、皂苷等活性成分对黑素生成量或对黑素细胞增殖抑制作用影响等，来进行美白祛斑评价；Fang等[21]通过测定黑色素形成过程中酪氨酸酶、氧化酶和多巴色素互变酶的mDNA和DNA的表达水平及酪氨酸酶的合成量来评价药用植物的美白功效。此外，对化妆品的保湿性能则可以通过测试体外培养的皮肤角质细胞中透明质酸(HA)、紧密连接蛋白(Claudins)、天然保湿因子(NMF)、水通道蛋白(AQPs)等指标的使用前后变化来评价[22]。表2中给出了目前基于细胞生物学层面的化妆品常见评价方法。

表2 细胞生物学方法评价化妆品的安全与功效Table 2 Safety and efficacy evaluation of cosmetics using cell biological methods

2.3 斑马鱼模型成为动物实验的主要替代

斑马鱼经济低廉，饲养空间小，单次产卵数量大，胚胎透明，不需要解剖即可在显微镜下进行观察，是一种高通量的模式生物。更为重要的是，斑马鱼的皮肤也和人类皮肤一样分为表皮、真皮、下表皮等几个部分，皮肤发育也和人类皮肤发育有较大相似之处，因此，可以通过建立斑马鱼模型来替代动物实验模型，作为细胞与人体评价之间的重要过渡，为化妆品的安全和功效评估提供重要的依据。目前，斑马鱼模型已经开始用于动植物提取物、抗菌剂、防晒剂等化妆品成分安全性的评价中。

在化妆品的安全性评估方面，可以用斑马鱼的胚胎来验证化妆品的急性胚胎毒性。将斑马鱼胚胎暴露化妆品中，观察死亡率、畸形率、畸形形态以及胚胎的孵化率，通过计算半数致死浓度（LC50）、半数致畸浓度（EC50）、致畸指数（TI）等指标来探讨其对斑马鱼胚胎和幼鱼的急性毒性[23]。Liu等[24]利用斑马鱼体内模型检测球形红细菌提取物（LycogenTM）的生物毒性，结果显示浓度高达100 μmol/L的LycogenTM不会对斑马鱼产生毒性。也可以对斑马鱼整体观察评价，观察斑马鱼各器官如心脏、脑部、鳍、身体水肿、出血、着色等毒性反应情况（见图2），统计毒性发生率，验证供试品对斑马鱼的胚胎毒性情况[25]。

图2 斑马鱼胚胎毒性表型图Figure 2 Zebrafish embryotoxicity phenotype

斑马鱼模型也可以用在化妆品的功效评价方面。例如，斑马鱼皮肤中的黑色素调控机制与人类高度一致，且生成速度快，肉眼能在显微镜下清晰观察，配合图像处理技术即可对化妆品减少黑色素的程度和体内酪氨酸酶活性进行定量分析，实现对美白功效的评价[26]。Cha等[27]通过斑马鱼模型研究发现两种海藻植物腔昆布（EC）和裂叶马尾藻（SS）的提取物有抑制酪氨酸酶活性的作用，有望作为化妆品的美白剂。Lin等[28]选用斑马鱼体系评价红车轴草中提取出的鹰嘴豆素A的体内安全性和黑色素抑制效应，证实88 mol/L鹰嘴豆素A不具有毒性，且其黑素抑制和酪氨酸酶抑制效应较为明显。在化妆品修复功效评价方面，斑马鱼成体组织、器官和鱼鳍均有可再生性，切断荧光标记斑马鱼的尾鳍后，斑马鱼炎症模型在几个小时内即可建立，且尾鳍面积大易操作与观测，因此斑马鱼成体尾鳍组织被广泛运用检测护肤品的修复功效[29]。Cheng等[30]等利用斑马鱼模型评估了紫草树叶提取物对UV引起皮肤损伤的化学防护能力，证实紫草提取物具有降低吸收紫外线和降低ROS浓度的能力，从而减少UV介导的细胞凋亡，并据此认为紫草树叶提取物有开发作为UV保护剂的潜力。斑马鱼模型在补水保湿功效评价方面也有重要的用途。一般传统保湿功效评价方法为用皮肤角质仪测量面部不同部位皮肤含水率、用水分仪测量经皮失水率及用皮脂仪测量评估皮脂分泌量。仪器依赖性强，对志愿者要求高。在这方面，斑马鱼表皮就表现出优良的性能，超出鱼皮的渗透压耐受范围将会使斑马鱼产生脱水现象，尾部面积也会变小，因此通过高渗透溶液建立斑马鱼补水保湿诱导模型后，可以用来评估化妆品的保湿功效。用荧光PCR手段检测相关基因如AQP3等的表达量可以评估化妆品的补水保湿功效[31]。表3中给出了目前基于斑马鱼模型的化妆品常见评价方法[32-34]。

表3 利用斑马鱼模型建立的化妆品常见评价方法Table 3 Common evaluation methods for cosmetics established using zebrafish model

目前，斑马鱼模型除了在美白功效评价中形成了团体标准外,在其他功效性评价和安全性评价中均未有固定的评价标准，这成为未来化妆品行业功效评价和安全性评价的新目标。

3 结语

作为世界上植物资源最丰富的地区之一，我国拥有数以万计的化妆品可用植物资源有待开发[35]。以现代新技术，高效进行化妆品新原料开发，是化妆品企业在新形势下抢占市场制高点的重要战略手段。计算机辅助药物设计、细胞生物学及斑马鱼模型等在药物研发领域已经被证实是强有力的工具手段，将其导入化妆品功效原料的开发过程已经引起了充分重视。随着这些生物技术手段在开发化妆品功效原料中的应用越来越广泛，传统化妆品行业内研发周期冗长、目标原料不明确、产品功效难以理解等问题有望得到解决，我国植物源化妆品的安全和功效评价体系将进一步完善。利用现代生物技术方法，建立统一的化妆品功效评价系统，建立完善的植物源化妆品安全与功效评价体系，这对净化国内化妆品市场、维护我国化妆品行业的健康发展，具有极为重要的意义。