盐炙车前子多糖抗痛风性肾病作用研究

彭东辉 ，张志宏 ，王洋洋 ，孙延平，曾元宁 ，，王秋红 ，匡海学

（1.黑龙江中医药大学/教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006）

车前子为车前科车前PlantagoasiaticaL.或平车前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟种子[1]，主要含有苯乙醇苷、黄酮、环烯醚萜和多糖等成分，具有清热、利尿、通淋、明目的功效[2]。现代药理研究发现车前子提取物对痛风有一定的治疗效果，能够显著降低患者的血尿酸（UA）水平，同时抑制炎症因子的分泌[3-5]。车前子炮制方法历史悠久，如《幼幼集成》中“青盐水炒七次”。现代炮制规范和药典中，关于车前子炮制方法的一般有3种，即净制、炒制和盐炙。车前子盐炙后，能引药下行而入肾经，泄热利尿而不伤阴，增强车前子的泄热利尿作用[1，6-7]。

痛风性肾病是由于体内UA产生过多或排泄减少，血UA水平长期处于过饱和状态，尿酸结晶沉积于肾脏的肾髓质、间质以及远端集合管，最终导致肾实质性病变，临床主要表现有水肿、尿结石、多尿、夜尿、血、尿UA升高、高血压及肾小管的功能性损害等[8]。车前子多糖具有免疫调节功能，抗氧化和降尿酸作用[9-11]，但目前关于盐炙车前子多糖的研究很少。因此，本研究采用水提醇沉法提取盐炙车前子多糖，并采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考马斯亮蓝法和PMP衍生化法，对多糖进行初步研究；采用腺嘌呤和酵母联用的方法制备痛风性肾病模型大鼠，来研究盐炙车前子多糖的抗痛风性肾病作用，为开发治疗痛风的新型、有效、低毒药物提供依据[12]。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

5～6周龄SPF级SD雄性大鼠60只，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0002，体质量（200±20）g，适应性喂养1周后开展实验。

1.2 药物与试剂

药材：车前子药材产地江西（批号YCB0F000 1），经中药学院李书渊教授鉴定为车前科车前PlantagoasiaticaL.的干燥成熟种子。

试剂：牛血清白蛋白（批号224V055），北京博奥拓达科技有限公司；考马斯亮蓝G-250（批号626M035），天津市光复精细化工研究所；咔唑（批号C10196252），美国 Sigma公司；葡萄糖（Glc批号CHB180929）、岩藻糖（Fuc批号CHB1800602）、阿拉伯糖（Ara批号 CHB180206）、半乳糖（Gal批号CHB180227）、鼠李糖（Rha批号CHB190217）、木糖（Xyl批号CHB180301）、甘露糖（Man批号CHB180615）等单糖标准品均购自成都克洛玛生物科技有限公司，纯度均不低于98%；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（批号C10661531），上海麦克林生化科技有限公司；三氟乙酸（批号76-05-1），上海阿拉丁生化科技有限公司；腺嘌呤（批号A6279），Macklin公司；酵母干粉（批号050090），广东环凯微生物科技有限公司；别嘌醇片（国药准字H34021248），合肥久联制药有限公司；尿蛋白定量试剂盒（批号C035-2-1）、尿素氮（BUN）测试盒（批号C013-2）、UA检测试剂盒（批号C012-2）、肌酐（CRE）测定试剂盒（批号C011-2-1），南京建成生物工程研究所；浓硫酸、苯酚、95%乙醇等试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 主要仪器

UV-1800紫外可见分光光度仪（日本岛津公司）；N1300旋转蒸发仪（东京理化株式会社）；98-1-B调温电热套（天津泰斯特仪器有限公司）；H1750R高速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；ME104电子分析天平（梅特勒-托利多国际贸易有限公司）；X-15R台式离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；Epoch-2酶标仪（美国Bio-Rad公司）；ACQUITYArc超高效液相色谱仪、2489 UV紫外检测器、SunFire 5 μm 4.6×250 mm C18反向柱（美国Waters公司）。

2 方法

2.1 盐炙车前子多糖的提取

取盐炙车前子500 g，先醇提3次，将醇提后的车前子按照料液比（g∶mL）1∶10，热水回流提取3次，每次2 h，过滤，合并提取液，减压浓缩，4℃条件下醇沉过夜，连续醇沉3次，将所得醇沉部分，无水乙醇和丙酮交替洗3次，低温烘干，即得盐炙车前子多糖。

2.2 盐炙车前子多糖总糖、糖醛酸、蛋白含量测定

采用苯酚-硫酸法[13]、硫酸-咔唑法[14]、考马斯亮蓝法[15]，测定车前子多糖中总糖、糖醛酸、蛋白的含量。

定量称取105℃干燥1 h的葡萄糖标准品，配制成质量浓度为0.04 mg/mL的标准品溶液。精密量取葡萄糖标准品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6及1.8 mL分别置于10 mL具塞试管中，加双馏水补充至2.0 mL，再分别加入6%苯酚试剂1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，摇匀后常温放置5 min，水浴加热15 min，取出，冷却至室温（25℃）。另取蒸馏水2.0 mL，作空白对照，在490 nm处测定吸光度值（A）。同法操作3次，以Glc含量（μg）为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。精确定量称取盐炙车前子多糖，配制成浓度为0.08 mg/mL的样品溶液，按上述测定方法操作，平行测量3次，通过回归方程计算多糖的葡萄糖含量。

精密定量称取半乳糖醛酸对照品，配制成质量浓度为0.2 mg/mL的半乳糖醛酸标准品溶液。精密吸取半乳糖醛酸标准品溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，置于10 mL具塞刻度试管中，加水至1.00 mL，另取1.00 mL水作为空白对照，每管中加入浓硫酸5.00 mL，摇匀后，水浴加热25 min，取出，冷却到室温。再加0.1%咔唑乙醇溶液0.20 mL，摇匀，于沸水条件下水浴加热10 min，取出，冷却至室温，加入浓硫酸至10.00 mL，摇匀，在530 nm波长处测定吸光度值。同法操作3次，以半乳糖醛酸含量（μg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。精确定量称取盐炙车前子多糖，配制成2.0 mg/mL的盐炙车前子多糖样品溶液，按上述步骤操作，平行测量3次，依据回归方程计算多糖的糖醛酸含量。

精密定量称取牛血清白蛋白BSA-Ⅴ，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的牛血清白蛋白BSA-Ⅴ溶液。精密吸取 BSA-Ⅴ溶液 0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，加入到10 mL具塞刻度试管中，补充水至1.00 mL，另取1.00 mL水作为空白对照，每管加入5 mL考马斯亮蓝染液，30℃恒温条件下水浴5 min，取出冷却，在595 nm处测定各管的吸光度。同法操作3次，以牛血清白蛋白BSA-Ⅴ（μg）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。精确称取盐炙车前子多糖，配制成2.0 mg/mL的盐炙车前子多糖样品溶液。按上述步骤操作，平行测量3次，依据回归方程计算多糖的蛋白含量。

2.3 盐炙车前子多糖单糖组成分析

采用PMP柱前衍生超高效液相色谱法对盐炙车前子多糖进行单糖组成分析[16]。

2.3.1 多糖水解 取多糖样品10 mg，置于10 mL具塞试管中，加入2 mol/L三氟乙酸（TFA）溶液2 mL，加盖密封，于120°C水解160 min，取出放置室温，减压蒸馏除去TFA，期间加入甲醇，反复蒸馏3～4次至无酸味，加入双蒸水2.0 mL溶解。

2.3.2 多糖衍生化 取配置好的标准单糖对照品，混合单糖对照品1.0 mL，分别置于5.0 mL离心管中，依次加入 500 μL 0.5 mol/L PMP 甲醇溶液和 500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，70°C水浴加热60 min，室温放置10 min；再加入500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，混匀后加入等体积的乙酸异戊酯萃取2次，氯仿萃取1次，取上层（甲醇-水相）过有机滤膜，供UPLC进样分析。液相方法：0～10～25～30 min，B相：20%～23%～24%～30%乙腈，D相：0.1%甲酸水，柱温35℃，检测波长254 nm。

2.4 痛风性肾病大鼠模型的建立、给药及取材

痛风性肾病模型建立[4,12,17]：大鼠适应性喂养后，随机挑选10只作为空白组，其余大鼠分为模型组、阳性药组、盐炙车前子多糖低、中、高剂量组，每组10只，建立痛风性肾病大鼠模型，采用酵母和腺嘌呤联用的方法，给药剂量分别为腺嘌呤100 mg/(kg·d)、酵母10 g/(kg·d)，给药体积为10 mL/kg；连续造模给药28 d。

给药：实验开始后，除空白组外，各组大鼠上午灌胃给予腺嘌呤和酵母混悬液，下午灌胃给予阳性药（别嘌醇）和盐炙车前子多糖，给药剂量参考2020年版《中国药典》，结合人与大鼠给药折算比例换算，确定车前子多糖低、中、高剂量组分别为0.135 g/(kg·d)、0.270 g/(kg·d)、0.540 g/(kg·d)，阳性药组别嘌醇的给药剂量为50 mg/(kg·d)，其余两组给予相同体积蒸馏水，连续给药28 d。

取材：分别于实验正式前、实验开始后的第7天、14天、21天、28天，收集大鼠24 h尿液，4℃，3 000 r/min离心10 min去除沉淀，取上清分装于ep管中。实验进行28 d后，各组大鼠麻醉后，腹主动脉取血，快速取大鼠双肾拍照并称质量。取右肾置于组织固定液中固定。大鼠血液在4℃，3 000 r/min的条件下，离心15 min，取上清液（血清），分装于不同规格的ep管中，尿液和血清均置于-80℃冰箱中保存。

2.5 肾表观特征

28 d后，麻醉取血，快速取大鼠双肾，观察表观特征并取双肾置于白纸上拍照记录。称重，计算肾质量指数。

大鼠的肾质量指数=（双肾质量/大鼠体质量）×100%。

2.6 肾组织病理学

固定液中的肾组织，石蜡包埋并切片，苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜（×100）下观察肾组织病理变化。

2.7 24 h尿蛋白及血生化检测

取离心后的各组血清，按照UA、CRE、BUN这3种试剂盒说明书的具体操作步骤，来检测其含量。将各组大鼠的24 h尿液，按尿蛋白定量试剂盒说明书的步骤方法，检测各个时间段各组大鼠尿液的24 h尿蛋白水平。

2.8 统计学处理

实验数据以xˉ±s表示，采用SPSS22.0统计软件对数据进行统计分析。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 盐炙车前子多糖的提取

按上述方法提取得到盐炙车前子多糖，其中多糖得率为10.90%。

3.2 盐炙车前子多糖总糖、糖醛酸、蛋白含量测定结果

采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考马斯亮蓝法，测定车前子多糖中总糖、糖醛酸、蛋白的含量，得到葡萄糖标准曲线的回归方程为Y=0.007 2x+0.030 5（R2=0.999 3）、半乳糖醛酸标准曲线的回归方程为Y=0.002x+0.032 2（R2=0.999 5）、蛋白标准曲线的回归方程为Y=0.004 7x-0.0075（R2=0.999 7）；经过计算，盐炙车前子多糖中总糖含量为32.27%，糖醛酸含量为30.71%，蛋白质的含量为3.46%。

3.3 盐炙车前子多糖单糖组成分析结果

采用PMP柱前衍生化法，测得7种单糖标准品的标准曲线分别是：Rha：Y=5E+08x+205 889（R2=0.999 5）、Gal：Y=5E+08x+249 206（R2=0.999 8）、Glc：Y=5E+08x+252 490（R2=0.999 8）、Ara：Y=6E+08x-139 516（R2=0.999 9）、Xyl：Y=6E+08x+212 922（R2=0.9997）、Fuc：Y=5E+08x+107768（R2=0.9999）、Man：Y=5E+08x+3E+06（R2=0.999 0）。盐炙车前子多糖主要由 Man、Rha、Gal、Glc、Ara、Xyl、Fuc组成，通过标准曲线计算可知其摩尔比为Man∶Rha∶Gal∶Glc∶Ara∶Xyl∶Fuc=1.07∶1.49∶5.46∶14.94∶14.34∶42.86∶3.63，由此可知，盐炙车前子多糖主要由Glc、Ara和Xyl组成，是阿拉伯木聚糖，与文献报道[18-20]一致。

3.4 肾表观特征

如图1所示，空白组大鼠双肾肾脏组织体积正常，表面呈红褐色，双肾表皮平滑，未见任何异常（图1-A）。模型组大鼠肾脏体积显著增大，表面可见十分密集的小白点，呈石斑样，伴有充血和水肿（图1-B）。阳性药组大鼠肾脏体积增大，表面充血，出现水肿，偶见小白点（图1-C）。多糖低剂量组大鼠肾脏体积增大，表面可见小白点，有水肿和充血（图1-D）。多糖中剂量组大鼠肾脏体积增大不明显，表面可见稀疏小白点，有轻微充血（图1-E）。多糖高剂量组大鼠肾脏体积基本无增大，表面呈红褐色，偶尔可见小白点，基本无水肿和充血（图1-F）。

图1 盐炙车前子多糖对痛风性肾病大鼠双肾表观特征的影响Figure 1 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on the apparent characteristics of both kidneys in gouty nephropathy rats

3.5 肾质量指数

由表1可知，与空白组比较，模型组肾质量指数明显增大，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，多糖高剂量组肾质量指数降低十分明显，差异有统计学意义（P＜0.01），阳性药组和多糖中剂量组肾重指数降低明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果提示阳性药别嘌醇、多糖中、高剂量均能降低痛风性肾病模型大鼠的肾质量指数。

表1 盐炙车前子多糖对痛风性肾病大鼠肾质量指数的影响Table 1 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on renal weight index in rats with gouty nephropathy(±s,n=10)

表1 盐炙车前子多糖对痛风性肾病大鼠肾质量指数的影响Table 1 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on renal weight index in rats with gouty nephropathy(±s,n=10)

与空白组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

组别空白组模型组阳性药组多糖低剂量组中剂量组高剂量组剂量/（mg·kg-1）--5 0 135 270 540肾质量指数/%0.70±0.03 1.67±0.20**1.44±0.09#1.54±0.19 1.48±0.07#1.33±0.18##

3.6 肾组织病理学

如图2所示，空白组大鼠右肾肾组织结构正常，肾小球形态正常，肾小管上皮细胞排列较为整齐，无炎症细胞浸润现象（图2-A）。模型组大鼠右肾肾组织产生显著病变，肾小球数目减少，肾小管上皮细胞有水肿现象，肾组织中随处可见大量尿酸盐结晶，炎症细胞大量浸润，并伴有肾间质纤维化（图2-B）。阳性药别嘌醇给药组与空白组比较，有较轻程度的肾组织病变，尿酸盐结晶减少，有一定程度的炎症细胞浸润，伴有轻微的肾间质纤维化（图2-C）。多糖低剂量组呈现稍微有点明显的肾组织病变，有较多尿酸盐结晶，有一定程度的炎症细胞浸润，伴有肾间质纤维化（见图2-D）。多糖中剂量组呈现一定程度的肾组织病变，有一定量的尿酸盐结晶，有一定程度的炎症细胞浸润，伴有一定程度的肾间质纤维化（图2-E）。多糖高剂量组呈现轻微程度的肾组织病变，偶见少量的尿酸盐结晶，有轻微的炎症细胞浸润，基本无肾间质纤维化现象（图2-F）。

图2 盐炙车前子多糖对痛风性肾病大鼠肾组织病理结构的影响Figure 2 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on renal pathological structure of gouty nephropathy rats

3.7 24 h尿蛋白及血生化检测

由表2可知，实验前，各组大鼠24 h尿蛋白水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。造模7 d后，与空白组比较，模型组的尿蛋白水平有一定的升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；造模14 d后，模型组的尿蛋白水平显著升高，与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；造模21 d后，与空白组比较，模型组24 h尿蛋白水平，持续升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性药组、多糖高剂量组与模型组比较，24 h尿蛋白含量有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；造模28 d后，模型组24 h尿蛋白水平与空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性药组、多糖中、高剂量组24 h尿蛋白水平显著降低，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 盐炙车前子多糖对痛风性肾病大鼠24 h尿蛋白水平的影响Table 2 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on 24-hour urinary protein level in rats with gouty nephropathy(±s,n=10)

表2 盐炙车前子多糖对痛风性肾病大鼠24 h尿蛋白水平的影响Table 2 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on 24-hour urinary protein level in rats with gouty nephropathy(±s,n=10)

与空白组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

组别空白组模型组阳性药组多糖低剂量组中剂量组高剂量组剂量/（mg·kg-1）24 h尿蛋白/（mg·L-1）--5 0 135 270 540 0 d 27.50±6.44 26.13±3.46 26.10±4.09 25.73±6.98 26.46±3.50 24.09±6.17 7 d 24.77±8.59 41.54±11.76 34.68±8.47 39.26±8.89 36.87±7.62 33.25±8.07 14 d 24.97±7.06 63.55±5.88**54.53±6.98 56.53±6.76 54.84±7.49 49.66±11.15 21 d 29.08±4.37 90.34±10.02**74.09±6.09#84.39±11.50 76.25±11.38 72.86±8.97#28 d 27.48±5.65 122.94±14.94**84.47±6.00##102.90±8.68 78.40±10.53##68.60±10.56##

由表3可知，模型组血清中UA、CRE、BUN水平显著升高，与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性药组、多糖中、高剂量组血清中UA、CRE、BUN水平降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表3。

表3 盐炙车前子多糖对痛风性肾病大鼠血清中UA、CRE和BUN水平影响Table 3 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on the levels of UA,CRE and BUN in serum of gouty nephropathy rats(±s,n=10) c/(μmol·L-1)

表3 盐炙车前子多糖对痛风性肾病大鼠血清中UA、CRE和BUN水平影响Table 3 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on the levels of UA,CRE and BUN in serum of gouty nephropathy rats(±s,n=10) c/(μmol·L-1)

与空白组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

组别空白组模型组阳性药组多糖低剂量组中剂量组高剂量组剂量--5 0 135 270 540 UA 74.52±11.30 142.42±31.54**93.94±20.58##115.15±24.16 87.88±20.77##82.83±30.70##CRE 56.05±10.58 106.59±26.58**80.82±13.88#85.75±25.43 80.58±6.97#71.58±7.84##BUN 18.27±3.01 47.75±6.44**35.90±4.91##38.98±7.48#33.62±5.61##26.36±7.14##

4 讨论

在本研究中，通过水提醇沉法，提取得到盐炙车前子多糖，多糖得率为10.90%。采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考马斯亮蓝法，测得盐炙车前子多糖中总糖含量为32.27%、糖醛酸含量为30.71%、蛋白质的含量为3.46%。采用PMP衍生化法对多糖进行单糖组成分析，测得盐炙车前子多糖主要由Glc、Ara和Xyl组成，其摩尔比为Man∶Rha∶Gal∶Glc∶Ara∶Xyl∶Fuc=1.07∶1.49∶5.46∶14.94∶14.34∶42.86∶3.63，是一种阿拉伯木聚糖。

痛风性肾病是由于嘌呤代谢紊乱，体内血UA水平过高，UA结晶沉积于肾脏的肾髓质、间质以及远端集合管，引发肾实质性病变。目前临床上治疗痛风性肾病的主要药物也多为降UA或抑制UA生成的药物，来控制血UA的水平，进而缓解症状[21-23]。本研究结果显示，与模型组比较，阳性药组、盐炙多糖中、高剂量组血UA的水平均显著降低。

多种肾脏损伤疾病可表现为尿蛋白阳性，而尿蛋白本身又能加重肾小球硬化和肾间质纤维化的进程，进一步诱导肾脏损伤。因此常用尿蛋白的水平来判断肾脏是否有病变[24]。血清中的BUN和CRE是考察肾功能是否正常的重要指标。BUN是人体蛋白代谢的重要产物，肾脏是其主要的排泄器官，当肾功能受损时，BUN的浓度会升高。CRE是肌肉代谢的最终产物，可通过肾小球滤过排出体外，人体每日体内产生的肌酐，一般不受尿量影响可全部随尿排出。当肾功能衰退时，血清中CRE含量升高。因此，如果BUN和CRE二者同时升高，说明肾脏有严重损害[25-26]。本研究结果显示，模型组大鼠24 h尿蛋白水平，随造模时间的延长不断升高，血清中BUN和CRE的水平显著升高，与空白组比较，均有统计学意义。与模型组比较，阳性药组、盐炙车前子多糖中、高剂量组大鼠24 h尿蛋白水平，血BUN和CRE的水平均有所降低，具有统计学意义。综上所述，结合肾脏组织表观特征和肾组织病理变化观察结果表明，阳性药别嘌醇、盐炙车前子多糖可以改善肾小球滤过功能，降低痛风性肾病模型大鼠的血UA、BUN和CRE的水平，改善肾功能。提示盐炙车前子多糖对痛风性肾病大鼠具有预防作用，为盐炙车前子多糖用于治疗痛风性肾病奠定了基础。