不同产地佩兰UPLC指纹图谱研究

李素梅，罗思妮，毕晓黎，胥爱丽，李养学，肖观林，陈伟韬

[1.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）/广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095；2.佛山市中医院，广东 佛山 528000]

佩兰来源于菊科植物佩兰EupatoriumfortuneiTurcz.的干燥地上部分，具有芳香化湿、醒脾开胃、发表解暑的功效，用于治疗湿浊中阻、口中甜腻、口臭、暑湿表证、湿温初起等[1]，为常用化湿、醒脾、解表中药，用药历史悠久，在我国华南、西南、中南、华东、陕西、河北、山东及湖北等地均有分布[2]。佩兰主要含挥发油类[3-4]、黄酮类[5-7]、生物碱类[8-9]、脑苷脂类、蒲公英甾醇、蒲公英甾醇乙酸酯等成分[10]。药理研究表明，佩兰具有抗炎[11]、祛痰[12]、抗肿瘤[13]、抑菌[14-16]、增强免疫力[17-18]等作用。

目前，关于佩兰质量控制方面的研究报道较少，且主要集中在挥发油[19-21]分析和化学成分提取分析研究等方面[10]，均未涉及到佩兰药材的超高效液相色谱指纹图谱研究。2020年版《中国药典》收载的佩兰质量控制项目主要是定性鉴别和总挥发油含量，缺少具体的指标性成分要求。为了更全面地评价、控制佩兰的质量，本研究收集了6个不同产地的佩兰，采用UPLC技术建立了佩兰指纹图谱，旨在为佩兰的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TLE-204分析天平、XS205DU型分析天平（瑞士-梅特勒托利多仪器公司）；JJ500电子天平（常熟-双杰测试仪器厂）；KQ700DE超声清洗器（昆山超声仪器公司）；安捷伦1290超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 试药

香豆素对照品（批号：X-013-150801，纯度：98%），购自成都瑞芬思生物科技有限公司；24批佩兰药材经广东省中医药工程技术研究院刘法锦教授鉴定为菊科植物佩兰EupatoriumfortuneiTurcz的干燥地上部分，产地信息见表1；液相用甲醇为Merck色谱纯试剂，液相用水为屈臣氏水，甲醇、磷酸等其他试剂为分析纯。

表1 佩兰样品信息Table 1 Information of the E.fortunei

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以 Waters Cortecs UPLC T3（2.1 mm×150 mm，1.6µm）为色谱柱，以甲醇为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相 B，梯度洗脱（0～40 min，5%～100%A）；流速为0.25 mL/min；检测波长为230 nm；柱温为35℃；进样量为2µL。

2.2 供试品溶液的制备

取佩兰粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定质量，置锥形瓶中，精密加入70%（体积分数，下同）甲醇溶液10 mL，超声处理（功率700 W，频率45 kHz）提取20 min，取出，放冷，用70%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，提取液通过0.22µm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的配制

精密称取香豆素对照品5.36 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为0.210 1 mg/mL的对照品溶液，从中精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为21.01µg/mL的对照品溶液，备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 精密吸取70%甲醇溶液2µL进样，按“2.1”项下的色谱条件测定，结果见图1，专属性试验结果表明，该分析方法能正确检测所指认的共有峰，不受提取溶剂的干扰。

图1 专属性试验UPLC图Figure 1 The UPLC of specific test

2.4.2 精密度试验 取S1供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6针，以5号峰（香豆素）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，其中各共有峰相对保留时间的RSD在0.06%～0.12%之间，相对峰面积RSD在1.22%～2.33%之间，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取佩兰S1样品，按“2.2”项方法平行处理6份供试品溶液，再按“2.1”项色谱条件进样分析，以5号峰（香豆素）为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积RSD在1.42%～4.75%之间，表明方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取佩兰S1供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别在0、2、4、7、9、11、13、15、17 h分别进样分析，以5号峰（香豆素）为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积RSD在0.71%～1.92%之间，表明佩兰供试品溶液在17 h内稳定性良好。

2.5 佩兰对照指纹图谱的建立及相似度评价

取24批佩兰样品，按“2.2”项方法分别制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件，测定24批样品指纹图谱。将24批佩兰指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》（2012年版）进行评价，以S1为参照图谱，对照图谱生成方法为中位数法，时间窗设置为0.1，经过多点校正和峰匹配，得到24批样品的共有峰模式及佩兰对照指纹图谱，结果见图2、图3。其中标定了13个共有峰，通过与对照品比对，指认5号峰为香豆素。以5号峰（香豆素）为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2、表3。结果显示，13个共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.1%，而相对峰面积RSD值在36.55%～87.37%之间，表明不同产地佩兰的化学成分含量存在较大的差异。以生成的对照指纹图谱作为对照，计算各批次样品的相似度，结果见表4。可见，除S8外，24批样品相似度均大于0.90，表明不同产地的佩兰化学成分一致性较好。

表2 24批佩兰的共有峰相对保留时间Table 2 Relative peak time of common peaks of 24 batches of the E.fortunei

表3 24批佩兰的共有峰相对峰面积Table 3 Relative peak area of common peaks of 24 batches of the E.fortunei

表4 相似度评价结果Table 4 Results of similarity analysis

图2 佩兰对照指纹图谱Figure 2 Rreference fingerprint of E.fortunei

图3 24批佩兰指纹图谱共有峰模式Figure 3 The common peak pattern of the HPLC fingerprints of 24 batches of the E.fortunei

2.6 化学计量学分析

将24批佩兰指纹图谱中的13个共有峰峰面积导入IBM SPSS Statistics 21.0软件进行PCA分析，计算得到主成分特征值、累积贡献率，结果见表5。可见，PCA共提取3个特征值大于1的主成分，累积方差贡献率达87.450%，表明提取的前3个主成分可以代表佩兰指纹图谱共有峰中大部分的信息。旋转后的成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小[22]，结果见表6。结果显示，第1主成分主要反映了峰8、12、9、10、3、2、13、7、4对第1主成分的贡献；峰5、1对第2主成分的贡献较大；第3主成分主要反映了峰11、6的信息。将共有峰峰面积导入SIMCA 14.0软件进行PCA分析，得到主成分得分散点图见图4。可见，大部分样品较为集中，表明不同产地佩兰的差异性较小，提示地理环境等因素对佩兰药材质量的影响并不显著。

图4 主成分得分散点图Figure 4 PCA score plot

表5 特征值及方差贡献率Table 5 Characteristic value and variance contribution rate

表6 旋转后成分载荷矩阵Table 6 Factors loading matrix after rotating

3 讨论

本研究考察了不同的提取溶剂（50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、乙醇）、不同提取时间（5、10、20 min）和不同的提取方式（超声、回流）对佩兰指纹图谱的影响，结果发现以70%甲醇提取的指纹图谱信息最为丰富，且不同提取时间和提取方式的差异不明显，因此，选择以70%甲醇超声10 min作为供试品溶液的制备方法。通过考察不同的流动相体系，结果显示以甲醇-0.1%磷酸水溶液分离效果最佳，因此，选择以甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相。采用DAD检测器进行全波长扫描（190～400 nm），结果显示以220 nm为检测波长的指纹图谱色谱峰较多、基线稳定，因此，选择以220 nm作为检测波长。

本研究建立了不同产地佩兰药材的指纹图谱，标定了13个共有峰，并指认了其中的5号峰为香豆素。23批样品的相似度均大于0.90，其中1批样品相似度低于0.9，可能与生长年限、贮藏环境等因素有关，需进一步进行分析。相似度结果表明不同产地佩兰的化学成分种类一致性较高。PCA共提取了3个主成分。主成分得分散点图结果表明不同产地及来源的佩兰样品相似度较高，产地差异不易区分，与相似度评价结果一致。这可能是由于佩兰药材品质受产地环境影响不大，也为佩兰道地性不明显提供了佐证，提示佩兰药材的质量优劣可能与采收时间、加工方式等更为密切，因此下一步可以对不同采收时间、加工方式的佩兰药材进行指纹图谱研究。

本研究建立了佩兰药材的指纹图谱，但仅指认了其中的1个色谱峰，后续将结合液质联用技术对未知峰进行指认。另外，由于本研究采集的样本量较少，后续仍需进一步收集更多产地的多批次样品进行研究。

中药是通过多成分、多靶点、多通路发挥疗效的，仅仅对一类成分进行分析不能全面的评价其质量优劣。中药指纹图谱具有专属性高、稳定性好、整体性强的特点，能更全面的反映中药材整体的化学成分信息。本研究所建立的佩兰药材指纹图谱，为佩兰药材指标成分定量分析、完善佩兰药材的质量标准提供了科学的依据，同时，对含有佩兰的中成药质量标准研究也具有重要的参考价值。