西藏地区牦牛源沙门菌分离鉴定、血清分型及致病性研究

李天娇，班马泽郎，李登宇，张开琴，赵晓慧，王保宁，2，索朗斯珠

(1.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；2.四川大学华西基础医学与法医学院，成都 610041)

1 引 言

沙门菌(Salmonella)为革兰氏阴性短小杆菌，肠杆菌科沙门菌属[1].据国内外研究报道，沙门菌在多种动物中均有发现，在动物相关副产品及食材中也常有检出，所以沙门菌也是食源性疾病中最常见的病原菌之一，动物感染沙门菌时，常引起胃肠炎及局部炎症，严重时会引起不同程度的败血症[2-4].成牛感染时临床表现为水样或血样腹泻，严重时表现为呼吸系统疾病或流产；犊牛感染时死亡率高于成牛[5].牦牛是生长在我国高海拔地区的特有物种，西藏作为我国牦牛主产地之一，牦牛更是当地牧民的重要经济来源之一[6].自关龙伏等人[7]于1985年首次报道从青海牦牛源中分离出沙门菌后；张斌等[8]、柏雪等[9]和冯兰等[10]也陆续报道了青海、四川等地牦牛源沙门菌相关研究，说明沙门菌在高海拔牧区长期处于流行状态.加之，沙门菌主要以粪-口传播，牧区养殖模式又以放牧为主，利于沙门菌的传播，严重影响当地牦牛养殖产业的健康发展.

沙门菌血清型多达2500种，常见血清型均具有一定致病性，同时根据宿主的感染范围不同，血清型也会有所不同，致病性也有所差异[11].牛沙门菌病可由多种血清型引起，都柏林沙门菌为其中最主要的血清型，牛作为其天然宿主极易被感染，沙门菌也易导致母牛流产，犊牛死亡.了解宿主的优势血清型及致病性强弱，有助于为相关疫病提出较为针对性的防控管理措施.

目前，国内外针对牦牛源沙门菌的研究较少，西藏地区沙门菌感染情况、菌株的分离鉴定和优势血清型等相关方面的研究更甚.因此，本研究通过采集西藏拉萨市、林芝市、昌都市和山南市等西藏全部七地市牦牛源腹泻样品，对样品中的沙门菌进行分离鉴定及血清型分型，旨在了解西藏各地区牦牛源沙门菌感染情况及优势血清型分布情况，同时随机选取本试验中优势血清型沙门菌一株进行动物试验和病变组织切片，旨在了解其菌株的致病性强弱.为后续相关方面深入研究提供理论基础和数据支持.

2 材料与方法

2.1 材 料

牦牛源新鲜腹泻粪便，采集自西藏拉萨市、林芝市、昌都市和山南市等七地市，共199份，样品具体分布情况见表1.样品采集后及时编号，保存至-20 ℃冰箱.

表1 样品分布情况

BPW培养基、MRSV培养基购自美国BD公司；LB培养基、TTB培养基、SS培养基、BS培养基、TSI培养基、营养琼脂购自杭州微生物试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒购自青岛海博生物技术有限公司；TR101沙门菌属诊断血清试剂盒购自宁波天润生物药业有限公司；Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0)、DL 2000 DNA marker购自大连宝生物有限公司.试验动物为SPF级，4～6周年龄、体重18～20 g的KM小鼠72只，购自成都达硕实验动物有限公司.

2.2 方 法

2.2.1 细菌分离培养 将采集的样品参照GB4789.4-2010[12]和Liu等人[13]的方法进行分离培养.将样品接种于BPW培养液中，进行前期预增菌；将上述增菌液接种在MRSV半固体培养基上，进行初筛；初筛后的菌液在SS、XLT4选择性培养基上复筛；筛选出的单菌落进行革兰氏染色、镜检；并将符合形态特征的菌落接种于TTB培养液进行纯化.

2.2.2 生化试验 将TSI固体培养基制成斜面培养基，将纯培养菌液在TSI培养基上进行斜面穿刺，37 ℃培养12 h后观察结果.

2.2.3 PCR鉴定 利用高温裂解法提取菌株的DNA，并利用PCR技术检测菌株的特异性鉴定基因invA[14]，引物序列：5′-GTGAATTATCGCACGTTCGGCAA-3′；5′-TCATCGCACGTCAAAGGAACC-3′.将引物序列送至上海生工生物科技有限公司合成.

反应总体系25 μL，其中：DNA模板2 μL，Premix TaqTM12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O补充至25 μL.退火温度为61 ℃，共35个循环.PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并将扩增产物送至上海生工生物科技有限公司测序.

2.2.4 血清型鉴定 将TSB中纯培养菌液接种于营养琼脂上，37 ℃培养12 h.将培养基中的单菌落在玻片上与TR101沙门菌属血清诊断试剂盒(宁波天润生物药业有限公司)中的血清混合，观察凝集的情况并记录凝集情况，血清凝集结果根据Kauffman-white[15]标准进行分析.

2.2.5 测定菌株LD50从此次菌株优势血清型(Salmonelladublin)中随机选取一株沙门菌，该菌株编号为H42，测定其LD50.将驯养后的KM小鼠随机分成7组试验组，1组对照组，1组空白组，每组各8只小鼠.

表2 试验组小鼠注射菌量

2.2.6 病理切片 将攻毒后24 h内(急性)死亡小鼠，72 h后(慢性)死亡小鼠立即解剖后，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃组织、肠组织于无菌生理盐水洗涤后，用4%多聚甲醛进行固定，并将组织委托成都里来生物有限公司制作HE切片进行观察，并记录结果.

3 结 果

3.1 细菌分离纯化

将疑似菌落接种于SS固体培养基和BS固体培养基上，菌株在SS平板上生长出透明且中心带黑点的圆形单菌落，在BS平板上生长出黑褐色且带有金属光泽的圆形单菌落，将疑似单菌落染色镜检后，显微镜油镜下观察为粉红色短小杆菌.以上特征均符合沙门菌生长特性及形态学特征，结果见图1.

图1 分离菌株的菌落形态和镜检结果

分离菌株均能与TSI反应生成H2S黑色沉淀，且分解TSI中葡萄糖，使斜面变红，表面氧化后则变黄，符合沙门菌生化特性.

疑似沙门菌的单菌落进行特异性基因invA检测显示，分离菌株目的条带约为284 bp，与预期条带大小相似，结果见图2.将PCR结果结合培养特性、形态学特征及生化特性结果显示：西藏7地市共分离出50株沙门菌，检出率为25.13%(50/199).其中拉萨19株，检出率为32.20%(19/57)；林芝9株，检出率为19.57%(9/46)；那区7株，检出率为19.44%(7/36)；日喀则2株，检出率为20.00%(2/10)；山南4株，检出率为28.57%(4/14)；阿里2株，检出率为13.34%(2/15)；昌都7株，检出率36.84%(7/19).本次分离结果中，拉萨、昌都和山南三地分离率相较于其他四地较高，阿里地区的分离率最低.

图2 牦牛源沙门菌invA基因PCR结果

3.4 血清型鉴定

本次血清型分型结果显示：50株沙门菌共分属B群、C1群、C2群、D群4种血清群，含都柏林沙门菌、伤寒沙门菌、阿邦尼沙门菌等血清型共18种.按血清群统计结果显示：4种血清群中，以D群所占血清菌株最多，为常见血清群，含5种血清型，共20株分离菌；其次是B群含8种血清型，共19株菌；C1群占3种血清型，共9株菌；C2群占2种血清型，共2株菌，具体结果详见图3.

图3 50株牦牛源沙门菌所占血清群比例

从18种血清分型结果显示：西藏地区沙门菌的优势血清型为都柏林沙门菌共10株，占总分型菌株的20.00%(10/50)；其次是伤寒沙门菌和阿邦尼沙门菌个7株，占总分型菌株的14.00%(7/50)；接着是丙型副伤寒沙门菌共6株，占总分型菌株的12.00%(6/50)，血清型统计结果详见图4.

图4 50株牦牛源沙门菌血清型分布情况

从各地沙门菌血清分型结果显示：各地所占血清群、血清型数量均不相同.其中，拉萨市共有10种血清型，且4种血清群均有分布，以都柏林沙门菌和伤寒沙门菌为优势血清群；林芝市共5种血清型2种血清群，以都柏林和阿邦尼沙门菌为优势血清型；那曲市共5种血清型，以丙型副伤寒、伤寒沙门菌为优势血清型；日喀则两株分离菌均为伯里沙门菌；昌都市共包括6种血清型，以阿邦尼沙门菌为优势血清型；阿里和山南分离菌株均为不同血清型，具体结果详见表3.

表3 西藏各地市牦牛源沙门菌血清分型情况(单位：株)

3.5 牦牛源Salmonella Dublin感染小鼠的LD50

LD50试验结果(详见表4)，经SPSS 21.0软件分析，牦牛源都柏林沙门菌对感染小鼠的LD50为0.368×108CFU/mL，95%置信区间为0.311×108～0.434×108CFU/mL.

表4 各组小鼠感染牦牛源都柏林沙门菌死亡情况

3.6 病理切片

光镜下观察小鼠组织病理切片结果显示：急性(24 h内)死亡组小鼠的心脏、肠组织和胃组织相关细胞结构完整清晰无明显病变，肝脏、脾脏和肺脏相关细胞出现轻微坏死和变性.慢性(72 h后)死亡组小鼠心脏间质轻微炎细胞浸润，以淋巴细胞为主；脾脏相较于急性组较为严重，白髓和红髓细胞变性、坏死且细胞边缘基本消失，免疫细胞聚集增多；肺泡上皮细胞也相较于急性组严重，出现上皮细胞慢性坏死；肠组织黏膜层结构模糊，大面积溶解坏死，肠腔坏死区域细胞大量坏死，部分区域出现轻微充血扩张；胃部黏膜层也坏死溶解明显，结果详见图5.

图5 牦牛源都柏林沙门菌感染小鼠各病变组织病理切片

4 讨 论

沙门菌作为一类重要的食源性病原菌，宿主众多，可感染各个年龄段的牛只，以犊牛最为常见[17].李慧明等人[18]对四川省牦牛群调查结果显示，沙门菌引起的的牦牛发病率2.76%～34.82%，死亡率高达4.61%～47.32%.随着研究深入，国内各地有关牦牛源沙门菌的相关报道也逐步增多，说明沙门菌在牦牛群中处于长期流行状态，且死亡率也较高，但针对西藏牦牛源沙门菌相关研究报道却较为少见.本次研究中，西藏地区牦牛源沙门菌总分离率为25.13%，与逯玉等人[19]从青海犊牛腹泻样品的分离率24.00%结果相似.本次研究结果确定沙门菌在西藏牦牛源中存在，七地市均有分离说明该细菌在西藏存在一定的流行趋势.

目前，高原草场超载、矿元素缺乏等问题普遍存在于青藏高原等高海拔地区，这些原因可直接影响牦牛生长发育、机能维持等方面[20].而西藏整体处于该情况，加之牛群结构不合理、养殖模式单一，牛群常有未淘汰的老牛、未及时发现的病牛和抵抗力较弱的犊牛，导致牛群极易感染各类病原菌；并且在放牧情况下，病牛和隐性感染牛不易发现，污染放牧环境，加大牛群患病机率[21].本次研究结果提示我们需改善养殖方式和加强监管措施，减少感染机率，尤其分离率高的地区更应引起重视.同时，分离率最高的拉萨、昌都、山南三地，环境相似，海拔较为接近，但感染率高是否与海拔存在相关性，还需深入研究.

沙门菌对人和温血动物致病的血清型主要集中于A～F血清群，朱晓霞等人[22]针对四川藏区沙门分群中血清型也主要集中于B群、D群中，与本次试验中常见血清群结果相似，说明牦牛虽产地不同，但高海拔地区也存在一定的相似性.沙门血清根据宿主感染不同，存在专嗜性、偏嗜性、泛嗜性.牛沙门菌病可由多种血清型引起，都柏林沙门菌为牛源最主要的血清型，其次是鼠伤寒沙门菌，本次研究中以上两种血清型均有分离，都柏林沙门菌更是西藏牦牛源优势血清型[23].李慧明等人[18]针对四川牦牛源沙门菌鉴定结果显示，菌株中21.87%为都柏林沙门菌；20世纪80年代陈含义等人[24]和滕振光等人[25]分别从青海两地牦牛源中分离出的沙门菌也均为都柏林沙门菌；国外也曾有牛群感染都柏林沙门菌的报道.

本次试验中牦牛源都柏林沙门菌感染KM小鼠的半数致死结果为0.368×108CFU/mL，相较于冯兰等[10]感染小鼠的半数致死结果1.2×107CFU/mL较高，属于强致死性菌株.随后观察病变组织切片发现此株都柏林沙门菌可引起宿主全身性感染，心脏组织心肌纤维变性坏死，肝脏组织肝细胞变性坏死、肝窦淤血扩张，脾脏组织淋巴细胞减少、坏死、白髓萎缩、脾血窦淤血，肺脏组织支气管脱落、肺泡上皮细胞变性坏死、水肿、炎细胞浸润、出血，肠组织黏膜层变性坏死、充血，胃组织黏膜层变性坏死等病理改变，与对照组相比，急性组和慢性组均可见不同程度病理改变，且慢性组整体病理程度重于急性组，其中脾脏、肺脏、肠和胃组织病变程度较重.因此，我们需重视S.Dublin引起的危害，及时制定有针对性的防控管理措施.同时此次沙门血清分型种类较多，我们也需考虑存在多种血清型引起牛只患病的情况，需要我们提高对牛群沙门菌感染情况的重视.

此次牦牛源沙门菌中还分离出鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌，这两种血清型具有泛嗜性，拥有广泛感染的宿主谱，可引起人和多种动物相关沙门菌病，具有重要的公共卫生学意义[26].乙型、丙型副伤寒沙门菌主要造成人类食物中毒，孔雪英等人[27]曾从牦牛肉中检出这两种副伤寒沙门菌，说明牦牛在屠宰过程中可能感染沙门菌，而人类食用牦牛肉时，也存在一定的感染风险.因此我们需加强在牛只屠宰到销售过程中的监管环节，降低副产品被污染的机率.同时，病牛沙门菌作为罕见的非伤寒沙门菌，和纽波特沙门菌，在研究报道中主要是食物污染而引起的食物中毒，也需引起相关监管部门的重视[28,29].阿邦尼沙门菌毒性也较强，孙阳阳等人[30]曾在驴源中分离，陈俊等人[31]人则从鸭源中分离得到奥斯陆沙门菌，而本次牦牛源沙门分型结果中均分离得到这两种血清型，需考虑这两种血清型可能存在多种动物间交叉感染的情况.而伯里、阿雷查瓦莱塔、里森、塔西、仙台等血清型相关研究报道较少，是否具有较强毒性和致病性还需进一步研究.本次分型结果中沙门菌血清型种类较多，优势血清型特点突出，部分血清型宿主广泛、危害较大，提示我们需引起高度重视，也可针对相关优势血清型进行深入研究.

5 结 论

目前，国内外针对牦牛源沙门菌研究较少，有关全区牦牛源沙门菌的研究更少.本次实验针对西藏全区牦牛源沙门菌进行分离鉴定，确定沙门菌在西藏牦牛源中确实广泛存在，且具有一定流行趋势；本次试验也确定了西藏地区的常见血清群和优势血清型；确定了牦牛源S.Dublin具有较强的致病性.为以后相关方面深入研究提供理论基础，也为相关部门防治提供数据支撑.