石榴皮多酚对食管癌EC9706细胞的增殖及凋亡影响

蔡曼妮，韩向阳，黄咏东，邓桃极，王裕宣，丁祥武，颜悦蓉*

(1.海南医学院附属海南医院消化内科，海南 海口 570311；2.湖北文理学院附属医院，襄阳市中心医院消化内科，湖北 襄阳 441021)

近年来，从植物中寻找具有抗肿瘤作用的天然化合物是已成为肿瘤防治的研究热点[1-2]。石榴作为一种常见的食用、药用植物，在我国具有悠久的栽培历史。目前，石榴以果汁、葡萄酒或天然水果的形式被广泛食用。石榴多酚是从石榴皮、果肉、和石榴籽中提取的多酚类化合物，其含量在石榴皮中尤其丰富。石榴多酚除具有抗菌、抗氧化、调节血脂等保健和药用功能外，石榴多酚还具有抗肿瘤作用[3-6]。石榴皮多酚可诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞G2-M期阻滞，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡[7]。此外，石榴皮多酚对前列腺癌细胞株PC-3具有显著的生长抑制和凋亡促进作用[8]。然而，石榴皮多酚是否具有抗食管癌作用尚未可知。本研究通过观察石榴皮多酚对体外培养的食管癌细胞EC9706增殖和凋亡的影响，进一步探索其作用机制，以期为石榴皮多酚的后续开发应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 细胞 人食管癌细胞EC9706购自上海弘顺生物科技有限公司。

1.2 试剂与药物 石榴皮多酚(纯度≥80%，CAS号65995-64-4)购自西安萃之健生物科技有限公司。RNeasy试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；第一链cDNA合成试剂盒、SYBRTMGreen PCR Master Mix购自宝生物工程(大连)有限公司；DMEM培养液、胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亚砜购自美国Sigma公司；FAM96B过表达质粒(pcDNA-FAM96B)、质粒空载体(pcDNA)、FAM96B小干扰RNA(si-FAM96B)、乱序无意义阴性对照(si-NC)由上海英杰制模有限公司提供；膜联蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；兔抗人细胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bcl associated X protein，Bax)、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体以及山羊抗兔IgG二抗购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.3 细胞培养和实验分组 EC9706细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37 ℃、5% CO2、湿润细胞培养箱中培养。石榴皮多酚采用二甲基亚砜溶解，配置成100 mg/mL的母液，于-20 ℃冰箱保存备用，实验时稀释为所需质量浓度。将对数期EC9706细胞分为对照组(常规培养)；石榴皮多酚低、中、高剂量组(分别采用石榴皮多酚终质量浓度为100、200、400 μg/mL的培养液处理24 h)；pcDNA组(转染pcDNA)；pcDNA-FAM96B组(转染pcDNA-FAM96B)；石榴皮多酚+si-NC组(转染si-NC后采用石榴皮多酚终质量浓度为400 μg/mL的培养液处理24 h)；石榴皮多酚+si-FAM96B组(转染si-FAM96B后采用石榴皮多酚终质量浓度为400 μg/mL的培养液处理24 h)。细胞处理后，对各指标进行检测。细胞转染参照Lipofectamine 3000说明书进行。

1.4 RT-qPCR检测食管癌组织中FAM96B表达 利用RNeasy试剂盒分离总RNA。利用第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录反应合成cDNA。以cDNA为模板，利用SYBRTMGreen PCR Master Mix进行RT-qPCR反应。2-ΔΔCT法分析FAM96BmRNA表达。FAM96B正向引物5′-GGAGTTGAACGTAGTAGAGCAGG-3′，反向引物5′-GACAGACCAATAAGGGTGGC-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTGG-3′，反向引物5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。

1.5 MTT法检测EC9706细胞活力 每组取5×103个细胞分别铺到96孔板，每孔加入20 μL MTT试剂，培养箱孵育2 h，弃去孔板中液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡器轻轻震荡10 min。空白孔调零，全自动酶标仪检测490 nm波长各孔吸光度值(A)，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-(A实验组/A对照组)]×100%

1.6 流式细胞术检测EC9706细胞凋亡 收集细胞，PBS洗涤2次，加入适量结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞密度为5×105/mL，取100 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，室温避光孵育15 min，再加入5 μL PI染色，补充结合缓冲液至500 μL后上机检测细胞凋亡情况。

1.7 Western blot检测FAM96B、CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达 收集各组EC9706细胞，PBS洗涤2次，采用RIPA裂解液提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取30 μg变性后的细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳，湿法转移至聚偏二氟乙烯膜；加入3%脱脂奶粉，于4 ℃封闭过夜，洗膜后加入稀释的FAM96B、CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax抗体室温孵育2 h；洗膜后加入稀释的二抗室温孵育膜1 h，电化学发光试剂显色，Quantity One软件对蛋白条带进行灰度分析，以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的相对表达。

2 结果

2.1 石榴皮多酚对EC9706细胞增殖的影响 与对照组比较，石榴皮多酚各剂量组EC9706细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表达降低(P<0.05)，p21蛋白表达升高(P<0.05)；与石榴皮多酚低剂量组比较，石榴皮多酚中、高剂量组EC9706细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表达降低(P<0.05)，p21蛋白表达升高(P<0.05)；与石榴皮多酚中剂量组比较，石榴皮多酚高剂量组EC9706细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表达降低(P<0.05)，p21蛋白表达升高(P<0.05)，见图1、表1。

图1 各组细胞增殖相关蛋白表达

表1 石榴皮多酚对食管癌EC9706细胞增殖的影响

2.2 石榴皮多酚对EC9706细胞凋亡的影响 与对照组比较，石榴皮多酚各剂量组EC9706细胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高(P<0.05)；与石榴皮多酚低剂量组比较，石榴皮多酚中、高剂量组EC9706细胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高(P<0.05)；与石榴皮多酚中剂量组比较，石榴皮多酚高剂量组EC9706细胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高(P<0.05)，见图2、表2。

图2 石榴皮多酚对EC9706细胞凋亡蛋白(A)及凋亡率(B)的影响

表2 石榴皮多酚对EC9706细胞凋亡的影响

2.3 FAM96B在食管癌组织中的表达 与癌旁组织比较，食管癌组织中FAM96B mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05)，见图3、表3。

图3 食管癌组织及癌旁组织中FAM96B蛋白表达

表3 FAM96B在食管癌组织中的表达

2.4 FAM96B过表达对EC9706细胞增殖和凋亡的影响 与pcDNA组比较，pcDNA-FAM96B组EC9706细胞中FAM96B蛋白表达升高(P<0.05)，说明转染成功。与pcDNA组比较，pcDNA-FAM96B组EC9706细胞增殖抑制率、凋亡率、p21和Bax蛋白表达均升高(P<0.05)，p21和Bcl-2蛋白表达均降低(P<0.05)，见图4、表4。

注：A为FAM96B和增殖、凋亡相关蛋白表达，B为细胞凋亡流式图。图4 FAM96B过表达对EC9706细胞增殖和凋亡的影响

表4 FAM96B过表达对EC9706细胞增殖和凋亡的影响

2.5 石榴皮多酚对EC9706细胞中FAM96B表达的影响 与对照组比较，石榴皮多酚各剂量组EC9706细胞中FAM96B mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05)；与石榴皮多酚低剂量组比较，石榴皮多酚中、高剂量组EC9706细胞中FAM96B mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05)；与石榴皮多酚中剂量组比较，石榴皮多酚高剂量组EC9706细胞中FAM96B mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05)，见图5、表5。

图5 各组细胞中FAM96B蛋白表达

表5 石榴皮多酚对EC9706细胞中FAM96B表达的影响

2.6 抑制FAM96B表达逆转了石榴皮多酚对EC9706细胞增殖和凋亡的作用 与对照组比较，石榴皮多酚高剂量组EC9706细胞增殖抑制率、凋亡率、FAM96B、p21和Bax蛋白表达均升高，CyclinD1和Bcl-2蛋白表达降低；与石榴皮多酚高剂量+si-NC组比较，石榴皮多酚高剂量+si-FAM96B组EC9706细胞增殖抑制率、凋亡率、FAM96B、p21和Bax蛋白表达均降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)，见图6、表6。

注：A为FAM96B和增殖、凋亡相关蛋白表达，B为细胞凋亡流式图。图6 各组细胞增殖和凋亡水平

表6 抑制FAM96B表达逆转了石榴皮多酚对EC9706细胞增殖和凋亡的作用

3 讨论

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，是引起肿瘤相关死亡的第六大原因。我国是食管癌高发国家之一，在卫生资源匮乏的西部地区居民的主要疾病负担[9]。临床手术是本病最常见的治疗方法，但由于食管癌复发率高，食管癌患者预后较差，5年生存率仍然很低[10]。因此，研究具有抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡的药物具有重大意义。本研究检测了不同质量浓度石榴皮多酚对EC9706细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，石榴皮多酚可抑制EC9706细胞增殖，诱导细胞凋亡。随着石榴皮多酚剂量的增加，其对EC9706细胞增殖抑制和凋亡促进作用明显增强。CyclinD1是一种细胞周期调控蛋白，其通过与细胞周期蛋白激酶结合，促进细胞周期向S期转化发挥促增殖作用，p21通过抑制CyclinD1/CDKs的形成发挥抗增殖作用[11]。Bax和Bcl-2是细胞抗凋亡家族的主要成员，Bax表达增加、Bcl-2表达降低可促进线粒体膜转换孔开放，促进细胞色素C释放，激活caspase级联反应，促进细胞凋亡[12]。本研究发现，石榴皮多酚可抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白表达，促进p21和Bax蛋白表达。以上结果表明，石榴皮多酚通过抑制EC9706细胞增殖，诱导细胞凋亡在食管癌中具有抗肿瘤作用。

96序列相似的家庭成员B(family with sequence similarity 96,member B，FAM96B)是一种由193个氨基酸组成的小分子蛋白。目前研究显示，FAM96B除在血管内皮细胞增殖、迁移及微管形成中发挥作用外，还可能就抑癌功能[13]。FAM96B在胃癌、肝癌、结肠癌中表达下调，其低表达与肿瘤的发生发展、侵袭转移密切相关，上调其表达可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导肿瘤细胞凋亡[14-17]。本研究发现食管癌组织中FAM96B表达降低，石榴皮多酚可增加EC9706细胞FAM96B的表达，提示石榴皮多酚的抗食管癌作用可能与上调FAM96B表达有关。进一步验证显示，过表达FAM96B可抑制EC9706细胞增殖，抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白表达，促进细胞凋亡，促进p21和Bax蛋白表达，与石榴皮多酚的抗肿瘤作用一致，表明FAM96B在食管癌中具有抑癌作用。此外，本研究显示，抑制FAM96B表达可逆转石榴皮多酚对EC9706细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，并影响其相关蛋白的表达。以上结果表明，石榴皮多酚在食管癌中的抗肿瘤作用与上调FAM96B表达有关。

综上所述，食管癌中FAM96B表达降低，石榴皮多酚通过上调FAM96B可抑制食管癌细胞EC9706增殖，诱导细胞凋亡。因此，石榴皮多酚在食管癌的预防治疗方面具有广阔的前景，本研究为石榴皮多酚的开发利用奠定实验基础。