石榴皮止泻散急性毒性研究

夏 方，赵丽丽，缪雨臻，兰新财，安丽娜，伊鹏霏，韦旭斌#

（1.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130012；2.浙江金大康动物保健品有限公司，浙江金华 321016；3.石家庄藏诺药业股份有限公司，河北石家庄 050021）

石榴皮止泻散是由石榴皮饮片和滑石经加工制成的散剂，具有涩肠止泻之功效，拟用于仔猪白痢。为评价该制剂的临床用药安全性，依据农业部兽药评审中心兽药急性毒性实验（LD50测定）指导原则[1]，参照中华人民共和国兽药典相关标准[2]，本项目组进行急性毒性研究，为亚慢性毒性试验、药效学实验剂量选择等提供依据。

1 材料

1．1 受试药物

石榴皮止泻散，由浙江金大康动物保健品有限公司生产，包装规格：100 g/袋，批号：20150526；用法：口服。

1．2 实验动物及其饲养条件

SPF 级昆明小鼠72 只，18～22 g，雌雄各半；SPF 级Wistar 大鼠72 只，雌雄各半，体重180～220 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，维持饲料购于辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0003。实验动物饲养在吉林大学实验动物中心动物房，动物房许可证号：SYXK（吉）2016-0001。大、小鼠饮用水为无菌水，雌雄动物分笼饲养；饲养温度控制在21℃～25℃之间，相对湿度控制在40%～70%；光照强度控制在200～300 lux；光源采取人工明暗各12 h；氨浓度控制在14 mg/m3以下；噪声控制在60 dB以下。

1．3 其它器材

大、小鼠灌胃器，1 ml、2.5 ml 注射器，电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司，LT 302），量杯，烧杯和毒理实验室常规设备等。

2 试验方法

2．1 小鼠经口急性毒性试验

2．1．1 预试验

试验设置高、中、低3 个剂量组，给药剂量分别为5000 mg/kg体重、1000 mg/kg体重、200 mg/kg体重，高、中、低剂量按5 倍依次递减以期找出4/4 致死剂量和0/4 致死剂量，每个剂量组均为4 只小鼠（雌雄各半），试验前禁食不禁水12 h。用蒸馏水将石榴皮止泻散水煎液稀释4 倍（1 ml 相当于250 mg 生药）、20 倍（1 ml 相当于50 mg 生药）、100 倍（1 ml 相当于10 mg 生药）后分别给高、中、低剂量组小鼠灌胃，小鼠灌胃体积为0.2 ml/10 g 体重。给药后观察小鼠的一般表现、中毒症状和死亡情况，观察期7 d。试验结果显示：预备试验中各剂量组实验动物均未见死亡，即高剂量组（5000 mg/kg 体重）亦未见死亡，因此正式试验的剂量定为5000 mg/kg 体重。

2．1．2 正式试验

根据预备试验结果，正式试验的给药剂量确定为5000 mg/kg 体重。将正式试验的30 只试验小鼠随机分为3 组，每组10 只（雌雄各半），每次取1 组进行试验，重复3 次，试验前小鼠禁食不禁水12 h。用蒸馏水将石榴皮止泻散水煎液稀释4 倍（1 ml 相当于250 mg 生药）后给小鼠灌胃，小鼠灌胃体积为0.2 ml/10 g 体重。给药后观察小鼠的一般表现、中毒症状和死亡情况，观察期7 d。如所有试验动物均未死亡，则试验结束时将受试动物进行大体剖检并做好记录。

2．1．3 最大给药量试验

取30 只小鼠随机分为3 组，每组10 只（雌雄各半），每次取1 组进行试验，重复3 次，试验前小鼠禁食不禁水12 h。将石榴皮止泻散水煎液浓缩至2 g 生药/ml，给小鼠灌胃，小鼠灌胃体积为0.2 ml/10 g 体重，每组重复给药3 次，每次间隔2 h。给药量达到120 g/kg 体重。给药后观察小鼠的一般表现、中毒症状和死亡情况，观察期7 d。如所有试验动物均未死亡，则试验结束时将受试动物进行大体剖检并做好记录。

2．2 大鼠经口急性毒性试验

2．2．1 预试验

试验设置高、中、低3 个剂量组，给药剂量分别为5000 mg/kg体重、1000 mg/kg体重、200 mg/kg体重，高、中、低剂量按5 倍依次递减以期找出4/4 致死剂量和0/4 致死剂量，每个剂量组均为4 只大鼠（雌雄各半），试验前禁食不禁水12 h。用蒸馏水将石榴皮止泻散水煎液稀释2 倍（1 ml 相当于500 mg 生药）、10 倍（1 ml 相当于100 mg 生药）、50 倍（1 ml 相当于20 mg 生药）后分别给高、中、低剂量组大鼠灌胃，大鼠灌胃体积为1 ml/100 g 体重。给药后观察大鼠的一般表现、中毒症状和死亡情况，观察期7 d。试验结果显示：预备试验中各剂量组实验动物均未见死亡，即高剂量组（5000 mg/kg 体重）亦未见死亡，因此正式试验的剂量定为5000 mg/kg 体重。

2．2．2 正式试验

根据预备试验结果，正式试验的给药剂量确定为5000 mg/kg 体重。将正式试验的30 只试验大鼠随机分为3 组，每组10 只（雌雄各半），每次取1 组进行试验，重复3 次，试验前大鼠禁食不禁水12 h。用蒸馏水将石榴皮止泻散水煎液稀释2 倍（1 ml 相当于500 mg 生药）后给大鼠灌胃，大鼠灌胃体积为1 ml/100 g 体重。给药后观察大鼠的一般表现、中毒症状和死亡情况，观察期7 d。如所有试验动物均未死亡，则试验结束时将受试动物进行大体剖检并做好记录。

2．2．3 最大给药量试验

取30 只试验大鼠随机分为3 组，每组10 只（雌雄各半），每次取1 组进行试验，重复3 次，试验前大鼠禁食不禁水12 h。将石榴皮止泻散水煎液浓缩至2 g 生药/ml，给大鼠灌胃，大鼠灌胃体积为1 ml/100 g 体重，每组重复给药3 次，每次间隔2 h。给药量达到60 g/kg 体重。给药后观察大鼠的一般表现、中毒症状和死亡情况，观察期7 d。如所有试验动物均未死亡，则试验结束时将受试动物进行大体剖检并做好记录。

3 结果

3．1 小鼠经口急性毒性试验

3．1．1 预试验

所有受试小鼠在试验观察期内均未见中毒症状，亦未见死亡。

3．1．2 正式试验

正式试验中受试小鼠在试验观察期内均未见中毒症状，亦未见死亡，且试验结束时大体剖检小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠道等组织器官未见异常变化（表1～2）。

表1 小鼠临床症状观察结果

表2 小鼠大体剖检观察结果

按5000 mg/kg 体重剂量经口给药，经3 次重复试验，在试验观察期内小鼠死亡率均为0%（0/10、0/10、0/10）（表3），可判定石榴皮止泻散对昆明小鼠经口急性毒性试验的LD50 大于5000 mg/kg 体重。

表3 小鼠死亡情况观察结果

3．1．3 最大给药量试验

所有受试小鼠在试验观察期内均未见中毒症状，亦未见死亡，且试验结束时大体剖检小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠道等组织器官未见异常变化。

120 g/kg体重剂量经口给药，经3次重复试验，在试验观察期内，各组小鼠死亡率均为0%，可判定石榴皮止泻散对昆明小鼠经口急性毒性试验的LD50大于120 g/kg 体重。

3．2 大鼠经口急性毒性试验

3．2．1 预试验

所有受试大鼠在试验观察期内均未见中毒症状，亦未见死亡。

3．2．2 正式试验

正式试验中受试大鼠在试验观察期内均未见中毒症状，亦未见死亡，且试验结束时大体剖检大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠道等组织器官未见异常变化（表4～5）。

表4 大鼠临床症状观察结果

表5 大鼠大体剖检观察结果

按5000 mg/kg 体重剂量经口给药，经3 次重复试验，在试验观察期内大鼠死亡率均为0%（0/10、0/10、0/10）（表6），可判定石榴皮止泻散对大鼠经口急性毒性试验的LD50大于5000 mg/kg 体重。

表6 大鼠死亡情况观察结果

组别 性别 动物数（只） 剂量（mg/kg） 中毒症状组3 雄性 5 5000 未见中毒症状雌性 5 5000 未见中毒症状

3．2．3 最大给药量试验

所有受试大鼠在试验观察期内均未见中毒症状，亦未见死亡，且试验结束时大体剖检大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠道等组织器官未见异常变化。

60 g/kg 体重剂量经口给药，经3 次重复试验，在试验观察期内，各组大鼠死亡率均为0%，可判定石榴皮止泻散对大鼠经口急性毒性试验的LD50大于60 g/kg 体重。

表7 实验动物中毒表现观察项目

4 讨论

石榴皮止泻散是以石榴皮和滑石为原料加工而成的中兽药制剂，石榴皮为石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮，味酸、涩，性温，归大肠经，具有涩肠止泻、止血，驱虫等功效，临床用于治疗泻痢，便血，脱肛以及虫积等病证[2～3]。石榴皮中多酚类成分占干重的10.4%～21.3%，主要为鞣质和黄酮类，包括石榴苷、石榴素、石榴鞣花素、石榴皮亭A、石榴皮亭B、没食子酸、安石榴林、鞣云实精、鞣花酸等，其次含有多种氨基酸，糖及其苷类、皂苷、有机酸、生物碱类、树脂、树胶、黏液质、果胶、甘露醇、香豆素、油脂类以及Ca、P、Mg、K、Na、Fe、Zn 等矿物质元素[4]。

石榴皮是一味具有悠久应用历史的中药，《中国人民共和国药典》和《中国人民共和国兽药典》均无“有毒”记载。武果桃等用石榴皮鞣质制成鞣质颗粒，经试验对鸡安全用量为每千克体重0.7～1.44 g/d[5]；李志富等用石榴皮醇提物对小鼠经口灌服进行急性毒性试验，结果证明，LD50均大于5000 mg/kg，认为其属实际无毒类物质[6]。

滑石是一味应用历史非常悠久的中药，首载于《神农本草经》，其味甘、淡，性寒；归膀胱、肺及胃经；具有利尿通淋，清热解暑和外用祛湿敛疮功效；主治热淋、石淋、湿热泄泻、暑热，外用治疗湿疹和湿疮等。滑石的主要成分为硅酸镁[Mg3（Si4O10）（OH）2]，还含有铝、锰、镍、钙、钾、铜、钡、钠等元素及少量杂质[7～8]。农以宁等做过滑石粉酸中可溶物安全性研究，证明其LD50大于5000mg/kg体重[9]。

本试验将石榴皮止泻散水煎液按5000 mg/kg体重对大、小鼠进行经口急性毒性试验研究，未出现明显的毒性反应；将石榴皮止泻散水煎液按120 g/kg 体重对小鼠进行经口急性毒性试验，未出现明显的毒性反应；将石榴皮止泻散水煎液按60 g/kg体重对大鼠进行经口急性毒性试验，未出现明显的毒性反应。表明该制剂具有较高的临床用药安全性。

5 小结

将石榴皮止泻散水煎液按5000 mg/kg 体重给大、小鼠灌胃，不能引起试验动物死亡，亦未见明显的临床毒性反应和剖检病变，表明石榴皮止泻散对大、小鼠经口急性毒性试验的LD50大于5000 mg/kg 体重，证明其实际无毒。将石榴皮止泻散水煎液按120 g/kg 体重对小鼠进行经口急性毒性试验，未出现明显的毒性反应和剖检病变；将石榴皮止泻散水煎液按60 g/kg 体重对大鼠进行经口急性毒性试验，未出现明显的毒性反应和剖检病变。表明该制剂具有较高的安全性。