补阳还五汤治疗腰椎间盘突出症作用机制的 网络药理学研究

王柠，何育风，揭宇予，左高骈，张龙，易树坚

(广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation，LDH)是导致腰腿痛的常见原因之一[1-2]，属中医学“腰痛”“痹证”范畴。以往的研究证实，补阳还五汤对于LDH具有较为理想的治疗效果[3]，但具体作用机制尚不明确。为此，本研究采用网络药理学方法探讨了补阳还五汤治疗LDH的作用机制，现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 补阳还五汤活性成分筛选及靶点预测利用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)检索并筛选补阳还五汤组成药物“黄芪”“当归”“赤芍”“川芎”“红花”“桃仁”的活性成分(筛选条件：口服生物利用度≥30%，类药性指数≥0.18)，然后在TCMSP中查询活性成分对应的靶点。在文献中查询补阳还五汤组成药物“地龙”的活性成分，在PubChem中检索后按照类药五原则[4]进行筛选；下载选定的“地龙”活性成分的3D结构式，导入Swiss target prediction数据库，获取对应的UniProtID，并通过UniProt数据库转换为基因名，从而得到对应的靶点。

1.2 补阳还五汤治疗LDH靶点预测利用在线人类孟德尔遗传(online Mendelian inheritance in man，OMIM)数据库、GeneCards数据库、Disgenet数据库检索LDH的靶点，关键词为“lumbar disc herniation”。去除重复值，得到LDH的靶点并导出检索结果。利用R3.6.3软件将检索到的补阳还五汤靶点和LDH靶点取交集，得到补阳还五汤治疗LDH的靶点。

1.3 补阳还五汤治疗LDH主要活性成分筛选分别整理补阳还五汤组成药物活性成分与靶点的相互作用关系，应用Cytoscape3.8.0软件构建补阳还五汤治疗LDH的“活性成分-靶点”网络并进行分析。

1.4 补阳还五汤治疗LDH关键靶点筛选利用STRING数据库分析补阳还五汤治疗LDH的靶点间的相互作用关系，设定“Organism”条件为“Homo sapiens”，然后利用Cytoscape3.8.0软件构建靶点蛋白互作网络，筛选补阳还五汤治疗LDH的关键靶点。

1.5 补阳还五汤治疗LDH靶点基因功能及信号通路分析利用R3.6.3软件对1.2中得到的补阳还五汤治疗LDH的靶点基因进行GO分析和KEGG分析(筛选条件均为P<0.05)，挖掘靶点的生物学功能和通路信息。

1.6 补阳还五汤治疗LDH主要活性成分与关键靶点分子对接从TCMSP和PubChem数据库下载主要活性成分的结构、从PDB数据库下载关键靶点的结构，通过OpenBabel3.0软件、Auto Dock1.5.6软件进行加氢、去电荷等处理，借助PyMOL软件寻找活性口袋，最后采用Vina软件进行分子对接。

2 结 果

2.1 补阳还五汤活性成分筛选及靶点预测结果共筛选到补阳还五汤的活性成分114个、靶点1151个，去除重复后获得活性成分47个、靶点265个(表1、表2)。

表1 补阳还五汤活性成分及靶点数量

表2 补阳还五汤活性成分筛选结果

续表2

2.2 补阳还五汤治疗LDH靶点预测结果从OMIM数据库、GeneCard数据库、Disgenet数据库共检索到LDH的靶点392个。将补阳还五汤靶点和LDH靶点取交集后得到补阳还五汤治疗LDH的靶点46个。

2.3 补阳还五汤治疗LDH主要活性成分筛选结果补阳还五汤治疗LDH的“活性成分-靶点”网络(图1)显示，补阳还五汤7种组成药物的47个活性成分通过调控46个靶点治疗LDH，度值排名前4的活性成分，即主要活性成分为槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)及黄芩素(baicalein)。

注：紫色和黄色代表补阳还五汤活性成分，红色代表补阳还五汤治疗腰椎间盘突出症靶点。

2.4 补阳还五汤治疗LDH关键靶点筛选结果补阳还五汤治疗LDH的靶点蛋白互作网络(图2)显示，度值排名前6的靶点，即补阳还五汤治疗LDH的关键靶点分别为JUN原癌基因(JUN proto-oncogene，JUN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、肿瘤蛋白P53(tumor protein P53，TP53)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)。

图2 补阳还五汤治疗腰椎间盘突出症靶点蛋白互作网络

2.5 补阳还五汤治疗LDH靶点基因功能及信号通路分析结果GO分析共得到2013个富集结果，其中生物过程1946个，主要涉及对营养水平的反应、对氧化应激的反应、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应等生物过程进行调节；细胞组分33个，主要涉及膜筏、膜微区、膜区、含胶原的细胞外基质等细胞组分；分子功能124个，主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、内肽酶活性等；生物过程、细胞组分、分子功能前10位的结果见图3。KEGG分析共得到142个富集结果，主要涉及晚期糖基化终末产物(advanced glycation end product，AGE)-晚期糖基化终末产物受体(advanced glycation end product receptor，RAGE)信号通路、白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)信号通路、TNF信号通路等，前30位的结果见图4。

图3 补阳还五汤治疗腰椎间盘突出症靶点基因GO分析柱状图

图4 补阳还五汤治疗腰椎间盘突出症靶点基因KEGG分析柱状图

2.6 补阳还五汤治疗LDH主要活性成分与关键靶点分子对接结果分子对接结果显示，4个主要活性成分(槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素)与6个关键靶点(JUN、TNF、AKT1、MAPK1、TP53、MMP9)均具有良好的结合能力，结合能均≤-5.0 kJ·mol-1(表3、图5)。

表3 补阳还五汤治疗腰椎间盘突出症主要活性成分与关键靶点的结合能 单位：kJ·mol-1

图5 补阳还五汤治疗腰椎间盘突出症主要活性成分与关键靶点分子对接图

3 讨 论

补阳还五汤出自清代医家王清任所著的《医林改错》，方中黄芪大补脾胃之气，气旺血行，瘀去络通；当归活血养血，化瘀而不伤血；赤芍、川芎、桃仁、红花协同当归活血祛瘀、行气通络；地龙通经活络，力专善走，周行全身。全方标本兼顾，补气而不壅滞、活血而不伤正，诸药合用，共奏补气、活血、通络之功。

通过活性成分筛选和靶点预测，共获得补阳还五汤的活性成分47个、靶点265个；从多个数据库共获得LDH的靶点392个，通过与补阳还五汤靶点取交集后得到补阳还五汤治疗LDH的靶点46个。这提示补阳还五汤可能通过多成分、多靶点、多途径发挥治疗LDH的作用。构建的“活性成分-靶点”网络显示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素的度值较高，可能是补阳还五汤治疗LDH的主要活性成分。

免疫和炎症反应是引起LDH的重要机制之一[5]。槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素均为黄酮类化合物，具有较强的抗氧化、抗炎、抗病毒作用[6]。Rotelli等[7]认为，槲皮素可阻断5-羟色胺产生的急性炎症反应。木犀草素主要通过作用于核因子-κB途径中的原癌基因酪氨酸蛋白激酶、激活蛋白AP-1途径中的MAPK、信号转导以及转录激活因子途径中的细胞因子信号传导3，来达到抗炎作用[8]。山柰酚可通过抑制脂肪形成、炎症、氧化应激、破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡，同时激活成骨细胞自噬来实现骨骼保护作用[9]。研究表明，黄芩素可通过减轻神经炎症反应、细胞凋亡和自噬发挥神经保护作用[10]。

靶点蛋白互作网络显示，JUN、TNF、AKT1、MAPK1、MMP9、TP53可能是补阳还五汤治疗LDH的关键靶点。JUN由多种蛋白复合体组成，参与细胞分化、增殖、凋亡等过程。TNF是一种由巨噬细胞或单核细胞在急性炎症过程中产生的炎性细胞因子，负责细胞内一系列导致坏死或凋亡的信号事件。Johnson等[11]认为，椎间盘退变主要表现为细胞和细胞外基质成分的变化，而细胞外基质成分的变化是椎间盘力学特性丧失，从而导致椎间盘退变的主要原因，而MMP是细胞基质降解酶中的主要酶类。在生理条件下，MMP可水解衰老和受损的椎间盘组织，其过度活化会导致椎间盘的退化并引起疼痛[12]。Lu等[13]的研究表明，TP53和血管内皮生长因子基因协同表达在退化的椎间盘组织中，共同作用于新生血管，加速椎间盘组织退化。

补阳还五汤治疗LDH的靶点基因功能及信号通路富集分析结果显示，补阳还五汤治疗LDH的分子生物学机制主要涉及AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路，参与对营养水平、氧化应激、脂多糖以及细菌起源分子的反应等生物过程。AGE-RAGE信号通路已被证实可通过激活Nox-1和减少SOD-1的表达来增强氧化应激反应[14]。另一项研究指出，RAGE的激活会引起与衰老相关的轻度全身性炎症反应[15]。IL-17家族通过相应的受体发出信号，激活包括核因子-κB、MAPK和增强子结合蛋白在内的下游途径，诱导抗菌肽、细胞因子和趋化因子的表达，在急性和慢性炎症反应中都起着至关重要的作用[9]。Jiang等[16]的研究表明，LDH患者椎间盘组织中IL-17和TNF基因表达高于健康人群。TNF是引起椎间盘退变的主要炎症物质之一，其作用机制主要是通过上调椎间盘细胞内MMP的活性，减少蛋白聚糖、胶原等物质诱导的弹性蛋白，抑制细胞外基质合成，造成不可逆性破坏[11]。分子对接结果显示，补阳还五汤治疗LDH的主要活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚及黄芩素与关键靶点JUN、TNF、AKT1、MAPK1、TP53、MMP9均具有较强的结合力。

本研究的结果提示，补阳还五汤可能是通过调控AGE-RAGE、IL-17及TNF等信号通路，减轻机体氧化应激反应、抑制炎症因子表达，发挥对LDH的治疗作用；槲皮素、木犀草素、山柰酚及黄芩素可能是补阳还五汤治疗LDH的主要活性成分，JUN、TNF、AKT1、MAPK1、MMP9、TP53是对应的关键靶点。